張 會(huì)，任 健

(1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2.農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

玉米胚芽粕中含粗蛋白質(zhì)18%～20%，粗脂肪1%～2%，粗纖維11%～12%。玉米胚芽榨油后，除油脂含量降低外，其他營養(yǎng)成分基本全部保留在粕中，但國內(nèi)工廠一般將玉米胚芽粕做飼料處理或棄掉，并沒有發(fā)揮其潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。

米曲霉是我國釀造醬油、酒類等食品工業(yè)的傳統(tǒng)生產(chǎn)菌種，是一種好氣性、易培養(yǎng)、產(chǎn)復(fù)合酶的菌株，可產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等[2]。經(jīng)米曲霉發(fā)酵后，玉米胚芽粕中粗纖維、植酸等難吸收的物質(zhì)被降解，與傳統(tǒng)從玉米胚芽粕提取的玉米胚芽蛋白相比，玉米胚芽粕經(jīng)發(fā)酵后再從中提取的玉米胚芽蛋白性質(zhì)有明顯改善。陳麗安[3]采用酶法提取的玉米胚芽蛋白在溶解性、乳化性以及乳化穩(wěn)定性方面都有較大提高，且溶解性在各pH范圍內(nèi)都能達(dá)到80%以上，受pH影響較小。王勇等[4]采用米根霉固態(tài)發(fā)酵玉米，結(jié)果發(fā)現(xiàn)玉米中總酚含量、抗氧化活性在發(fā)酵后得到顯著提高。發(fā)酵對(duì)拓寬玉米胚芽蛋白在如飲料、肉制品加工及Pickering乳液中的應(yīng)用有積極影響。

本試驗(yàn)以玉米胚芽粕為原料，利用米曲霉種曲對(duì)其進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，隨后利用堿溶酸沉法從發(fā)酵后的玉米胚芽粕中提取玉米胚芽蛋白，探究發(fā)酵前后玉米胚芽蛋白的表面疏水性、巰基含量及抗氧化活性等的變化，以期為玉米胚芽蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

玉米胚芽粕，黑龍江龍鳳玉米開發(fā)有限公司；米曲霉種曲，齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院提供；十二烷基磺酸鈉，上海生物工程有限公司；DPPH，上海生物工程有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

BS-11隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；TU-1810型紫外可見光分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RF5301PC熒光分光光度計(jì)，日本島津；L-8900型氨基酸分析儀，日立Hitachi公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 米曲霉固態(tài)發(fā)酵玉米胚芽粕

稱取50 g玉米胚芽粕于250 mL錐形瓶中，按一定料液比加入自來水混勻，將米曲霉按一定的接種量接種在玉米胚芽粕中，攪拌均勻，30℃靜置發(fā)酵一定時(shí)間。

1.2.2 玉米胚芽蛋白的提取

用粉碎機(jī)將發(fā)酵后烘干的玉米胚芽粕粉碎，過篩(100目)，用石油醚浸提方法對(duì)其進(jìn)行脫脂，再采用堿溶酸沉法提取玉米胚芽蛋白，NaOH 濃度為0.08 mol/L，酸沉的pH 為4.7，然后對(duì)其進(jìn)行水洗、中和、冷凍干燥，得玉米胚芽蛋白。

1.2.3 可溶性蛋白含量測定

采用福林酚法測定玉米胚芽蛋白中的可溶性蛋白含量[5]。

1.2.4 表面疏水性測定

參照Hayakawa等[6]的方法評(píng)價(jià)玉米胚芽蛋白的表面疏水性。

1.2.5 游離巰基含量測定

玉米胚芽蛋白游離巰基含量的測定參考Shimada等[7]的方法進(jìn)行。用Tris-甘氨酸緩沖液(Tris 0.086 mol/L，甘氨酸0.09 mmol/L，乙二胺四乙酸4 mmol/L，pH 8)配制3 mg/mL的玉米胚芽蛋白溶液，再加4 mg/mL 二硫代硝基苯甲酸(DTNB)0.02 mL，經(jīng)渦旋混合器迅速混合后在25℃下保溫反應(yīng)10 min，在5 000 r/min離心10 min，取上清液在412 nm處測定吸光度(A412)，以不加樣品的試劑溶液作空白。按下式計(jì)算游離硫基含量。

SH=73.53×A412×D/C

式中：SH為游離巰基含量，μmol/g；A412為加DTNB時(shí)樣品的吸光度；D為稀釋系數(shù)；C為樣品質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.2.6 抗氧化性測定

1.2.6.1 DPPH自由基清除率測定

參照Zhang等[8]的方法測定玉米胚芽蛋白DPPH 自由基清除率。

1.2.6.2 還原力測定

取2 mL質(zhì)量濃度為2 mg/mL的玉米胚芽蛋白溶液，加入2 mL磷酸鹽緩沖液、2 mL鐵氰化鉀溶液，均勻混合，在50℃水浴下保溫20 min，再加入2 mL三氯乙酸溶液，振蕩搖勻后離心。取上清液2 mL，加入2 mL去離子水和0.4 mL三氯化鐵溶液，振蕩搖勻后在50℃水浴下保溫10 min，在波長700 nm下進(jìn)行比色。以去離子水代替樣品重復(fù)以上操作作為空白，同時(shí)配制0.1 mg/mL的VC溶液，按照上述方法測定VC的還原力作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比。

1.2.7 氨基酸分析

參考GB/T 5009.124—2003的方法測定氨基酸含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 固態(tài)發(fā)酵單因素試驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間的確定

稱取50 g玉米胚芽粕，在米曲霉接種量4.8×108CFU/g、料液比1∶1條件下，發(fā)酵不同時(shí)間，提取發(fā)酵產(chǎn)物中的玉米胚芽蛋白，測定其可溶性蛋白含量，結(jié)果見圖1。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)玉米胚芽蛋白中可溶性蛋白含量的影響

由圖1可知，發(fā)酵時(shí)間對(duì)玉米胚芽蛋白中可溶性蛋白含量有一定的影響。在固定接種量和料液比的條件下，發(fā)酵初期，菌種生長繁殖旺盛，酶含量增多，發(fā)酵底物中的大分子有機(jī)物水解為小分子物質(zhì)，發(fā)酵產(chǎn)物中可溶性蛋白含量增加。發(fā)酵6 h時(shí)，可溶性蛋白含量最高，這可能是因?yàn)榇藭r(shí)酶含量較多，且酶活力最大。發(fā)酵6 h后，酶活力下降，不利于水解[9]，可溶性蛋白含量降低。

2.1.2 接種量的確定

稱取50 g玉米胚芽粕，在料液比1∶1、發(fā)酵時(shí)間6 h條件下，改變米曲霉接種量進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，提取發(fā)酵產(chǎn)物中的玉米胚芽蛋白，測定其可溶性蛋白含量，結(jié)果見圖2。

圖2 接種量對(duì)玉米胚芽蛋白中可溶性蛋白含量的影響

由圖2可知，隨著米曲霉接種量的增大，玉米胚芽蛋白中可溶性蛋白含量增加，在接種量為6.4×108CFU/g時(shí)達(dá)到最大，之后隨接種量增大可溶性蛋白含量降低。這可能是因?yàn)?，在一定的接種量范圍內(nèi)，隨著接種量的增加，菌種生長繁殖過程中產(chǎn)生的蛋白酶量增多，蛋白質(zhì)水解生成的肽增加，使玉米胚芽蛋白中可溶性蛋白含量增大，但接種量超過一定量后，米曲霉菌數(shù)量變大、消耗的營養(yǎng)物質(zhì)過多，導(dǎo)致米曲霉生長受到抑制，酶活力降低，從而使可溶性蛋白含量降低[10-12]。

2.1.3 料液比的確定

稱取50 g玉米胚芽粕，在米曲霉接種量6.4×108CFU/g、發(fā)酵時(shí)間6 h條件下，改變料液比進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，提取發(fā)酵產(chǎn)物中的玉米胚芽蛋白，測定其可溶性蛋白含量，結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對(duì)玉米胚芽蛋白中可溶性蛋白含量的影響

由圖3可知，在固定發(fā)酵時(shí)間和米曲霉接種量的條件下，料液比為1∶3時(shí)，可溶性蛋白含量最高，之后隨料液比增大可溶性蛋白含量降低。分析原因可能是固態(tài)發(fā)酵水分含量過低，影響營養(yǎng)基質(zhì)的溶解、傳遞以及顆粒的潤脹，不利于菌體生長。但水分含量過高不利于通氣，使基質(zhì)成團(tuán)，影響氧的傳遞和發(fā)酵熱的散失，不利于蛋白質(zhì)水解，且米曲霉產(chǎn)生的蛋白酶被稀釋，使蛋白酶與底物接觸概率下降，影響水解速率，可溶性蛋白含量減少[10]。

2.2 固態(tài)發(fā)酵正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)三因素三水平的正交試驗(yàn)以優(yōu)化玉米胚芽粕固態(tài)發(fā)酵條件，正交試驗(yàn)因素水平見表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表2可知，3個(gè)因素對(duì)可溶性蛋白含量的影響大小依次為B>A>C，發(fā)酵的最佳工藝條件為A2B3C1，即發(fā)酵時(shí)間6 h、接種量7.2×108CFU/g、料液比1∶2.5。在最佳發(fā)酵條件下，玉米胚芽蛋白中可溶性蛋白含量為0.827 g/g。

2.3 氨基酸組成分析

以最佳發(fā)酵條件下獲得的玉米胚芽粕和未發(fā)酵的玉米胚芽粕為原料，提取其中的玉米胚芽蛋白，測定玉米胚芽蛋白的氨基酸組成及含量，結(jié)果如表3所示。

表3 發(fā)酵與未發(fā)酵的玉米胚芽蛋白氨基酸組成 %

氨基酸玉米胚芽蛋白未發(fā)酵發(fā)酵天冬氨酸(Asp)5.057.13蘇氨酸 (Thr)?2.682.96絲氨酸 (Ser)2.763.37谷氨酸 (Glu)8.8410.87甘氨酸 (Gly)3.483.65丙氨酸 (Ala)3.933.90半胱氨酸(Cys)0.160.22纈氨酸 (Val)?4.334.65甲硫氨酸(Met)?1.261.25異亮氨酸(Ile)?2.843.67亮氨酸 (Leu)?5.986.79酪氨酸 (Tyr)2.362.96苯丙氨酸(Phe)?3.166.99賴氨酸 (Lys)?2.993.38組氨酸 (His)2.162.25精氨酸 (Arg)4.624.69脯氨酸 (Pro)3.273.63合計(jì)59.8772.36

注：*為必需氨基酸。

由表3可知，發(fā)酵后提取的玉米胚芽蛋白較未發(fā)酵提取的玉米胚芽蛋白的氨基酸總量提高了12.49個(gè)百分點(diǎn)，必需氨基酸含量從未發(fā)酵的23.24% 提高到29.69%，只有甲硫氨酸和丙氨酸分別下降了0.01個(gè)百分點(diǎn)和0.03個(gè)百分點(diǎn)，疏水性氨基酸(丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸)總量提高了6.29個(gè)百分點(diǎn)。

2.4 游離巰基含量、表面疏水性

以最佳發(fā)酵條件下獲得的玉米胚芽粕和未發(fā)酵的玉米胚芽粕為原料，提取其中的玉米胚芽蛋白，測定玉米胚芽蛋白游離巰基含量和表面疏水性，結(jié)果見表4。

由表4可知，經(jīng)發(fā)酵后，提取的玉米胚芽蛋白表面疏水性及游離巰基含量都有所提高，較未發(fā)酵提取的玉米胚芽蛋白的表面疏水性和游離巰基含量分別增加了10.3和1.5 μmol/g 。蛋白質(zhì)是由各種氨基酸相互連接而構(gòu)成的生物大分子，對(duì)蛋白質(zhì)的生物大分子結(jié)構(gòu)而言，表面疏水性作為影響分子間相互作用的主要因素，對(duì)蛋白質(zhì)功能特性有很大的影響[12-13]。有研究表明蛋白質(zhì)表面疏水性與蛋白質(zhì)的疏水性氨基酸總量成正相關(guān)，與親水性氨基酸總量不相關(guān)[14]。發(fā)酵后蛋白質(zhì)分子表面的疏水性殘基更多地暴露在表面，表現(xiàn)為一定的疏水性，表面疏水性提高。游離巰基反應(yīng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解折疊程度，發(fā)酵后提取的玉米胚芽蛋白的解折疊程度增強(qiáng)，分子結(jié)構(gòu)也趨于暴露式，游離巰基含量增大。

表4 發(fā)酵與未發(fā)酵玉米胚芽蛋白游離巰基含量和表面疏水性

2.5 抗氧化性

以最佳發(fā)酵條件下獲得的玉米胚芽粕和未發(fā)酵的玉米胚芽粕為原料，提取其中的玉米胚芽蛋白，測定玉米胚芽蛋白DPPH自由基清除能力和還原力，結(jié)果見圖4。

圖4 發(fā)酵與未發(fā)酵玉米胚芽蛋白抗氧化性比較

由圖4可知，發(fā)酵后提取的玉米胚芽蛋白 DPPH自由基清除率為76.5%，明顯高于DPPH自由基清除率為62%的未發(fā)酵提取的玉米胚芽蛋白，這是因?yàn)楦弑砻媸杷缘鞍赘菀浊宄杂苫?。發(fā)酵后提取的玉米胚芽蛋白還原力為0.81，略高于未發(fā)酵提取的玉米胚芽蛋白還原力。分析原因可能是因?yàn)榻?jīng)發(fā)酵酶解后，產(chǎn)生具有還原性的物質(zhì)，還原力增大[15]。

3 結(jié) 論

以玉米胚芽粕為原料，經(jīng)米曲霉固態(tài)發(fā)酵后，提取玉米胚芽蛋白。以玉米胚芽蛋白中的可溶性蛋白含量為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，并對(duì)發(fā)酵前后所提取的玉米胚芽蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行對(duì)比分析。試驗(yàn)確定最佳發(fā)酵工藝條件為：發(fā)酵時(shí)間6 h，接種量7.2×108CFU/g，料液比1∶2.5。在最佳發(fā)酵條件下，玉米胚牙蛋白中可溶性蛋白含量為0.827 g/g。經(jīng)米曲霉發(fā)酵后，提取的玉米胚芽蛋白的表面疏水性、游離巰基含量分別增加了10.3和1.5 μmol/g；氨基酸總量和疏水性氨基酸總量分別提高了12.49個(gè)百分點(diǎn)和6.29個(gè)百分點(diǎn)；抗氧化性(DPPH自由基清除率、還原力)也有所提高。利用米曲霉發(fā)酵玉米胚芽粕顯著改善了玉米胚芽蛋白的理化性質(zhì)，拓寬了玉米胚芽蛋白在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。