唐 雷，徐 芬，胡 星，李云飛

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中心醫(yī)院康復(fù)科，武漢 430000)

失眠是指無(wú)法入睡或保持睡眠狀態(tài)[1]。調(diào)查顯示，全球約有31%～56%的人受到失眠困擾[2]。長(zhǎng)期失眠不僅會(huì)使免疫功能下降，還會(huì)增加糖尿病、高血壓等疾病的風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。近年來(lái)，臨床上以藥物治療失眠為主，而大多數(shù)藥物長(zhǎng)期服用易產(chǎn)生耐藥性和依賴性[5]，因此研究非藥物治療的重要性日益凸顯[6]。

現(xiàn)代針灸中的電針“五臟俞”療法是在對(duì)失眠發(fā)病機(jī)制全面認(rèn)識(shí)基礎(chǔ)上制定的[7-8]。有研究顯示，睡眠剝奪能加快機(jī)體新陳代謝，增加自由基，降低超氧化物歧化酶(SOD)活性，并形成大量脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛(MDA)[9]。此外，失眠癥與神經(jīng)元活性也密切相關(guān)，PCPA長(zhǎng)時(shí)期刺激會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元線粒體功能損傷[10]。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)具有促進(jìn)多種神經(jīng)元存活和軸突再生、防止發(fā)育中神經(jīng)元凋亡、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放等作用，BDNF表達(dá)下調(diào)則可能對(duì)神經(jīng)可塑性造成有害影響[11]。NeuN是一種穩(wěn)定而敏感的成熟神經(jīng)細(xì)胞特異抗原結(jié)合物，參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、分化和功能，常作為成熟神經(jīng)元存活的主要檢測(cè)指標(biāo)[12]。

因此，本文筆者采用電針五臟俞治療PCPA致大鼠失眠，并從多方面觀察其療效，與常規(guī)藥物治療進(jìn)行對(duì)比，探討其干預(yù)失眠的作用機(jī)制，為臨床電針五臟俞治療失眠癥提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性Sprague Dawley大鼠購(gòu)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于SPF動(dòng)物房；PCPA、地西泮購(gòu)自Sigma公司；RIPA裂解液、TUNEL試劑盒、SOD試劑盒、MDA試劑盒購(gòu)自Bioswamp公司；BDNF抗體、NeuN抗體、GAPDH抗體購(gòu)自CST公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 PCPA誘導(dǎo)大鼠失眠模型的建立與評(píng)估 模型建立[13]：40只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、PCPA模型組、地西泮西藥組及電針療法組4組，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。PCPA模型組連續(xù)2 d腹腔注射PCPA混懸液(30 mg/100 g)，若大鼠出現(xiàn)易受聲光等激擾而狂躁不安、不讓抓握、晝伏夜出節(jié)律消失等行為，表明造模成功，而后不予以任何處理。地西泮西藥組造模成功后，連續(xù)7 d以地西泮(0.9 mg/kg)水溶液灌胃。電針療法組造模成功后連續(xù)7 d針刺治療大鼠肺俞、心俞、肝俞、脾俞、腎俞，頻率60 Hz，治療時(shí)間15 min，強(qiáng)度以針柄輕微顫動(dòng)為宜。

模型評(píng)估：行為學(xué)觀察，如模型組及干預(yù)組大鼠在第1次腹腔注射PCPA后28～30 h間，出現(xiàn)晝伏夜出節(jié)律消失，白天活動(dòng)不止，總睡眠時(shí)間減少，且性情煩躁，攻擊性增強(qiáng)，整體觀察與對(duì)照組明顯不同，則表明模型復(fù)制成功。體質(zhì)量監(jiān)測(cè)：正常對(duì)照組不給予任何處理。各組大鼠分別在實(shí)驗(yàn)前、造模第1天、治療第1天及治療第7天稱(chēng)量體質(zhì)量。

1.2.2 大鼠血清SOD活性和MDA含量測(cè)定 治療結(jié)束后次日麻醉大鼠，取腹主動(dòng)脈血5 mL，離心并收集上清，按試劑盒說(shuō)明操作分別檢測(cè)SOD活性和MDA含量。

1.2.3 大鼠海馬TUNEL染色 治療結(jié)束次日處死大鼠取出海馬，4%多聚甲醛固定48 h。各組樣本制石蠟切片，脫蠟水化，按試劑盒說(shuō)明操作分別進(jìn)行染色并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 RT-PCR、Western blot檢測(cè)大鼠海馬NeuN、BDNF的mRNA及蛋白表達(dá) 治療結(jié)束次日處死大鼠取出海馬，一部分樣品提總RNA并反轉(zhuǎn)錄，行cDNA擴(kuò)增。條件為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性7 s，56 ℃退火延伸30 s，45個(gè)循環(huán)。剩余海馬樣品RIPA提取總蛋白。SDS-PAGE后，分別以稀釋比1∶500、1∶500、1∶1000加NeuN、BDNF、GAPDH一抗，4 ℃孵過(guò)夜；加二抗，采用化學(xué)發(fā)光儀曝光條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)大鼠行為學(xué)與體質(zhì)量的影響

圖1顯示，給予PCPA注射大鼠約24 h后對(duì)外界聲光刺激異常敏感，興奮性增強(qiáng)，晝夜節(jié)律紊亂，表明失眠模型復(fù)制成功。地西泮西藥組及電針療法組大鼠經(jīng)治療后，精神狀態(tài)、行為活動(dòng)趨于正常，晝夜節(jié)律逐漸恢復(fù)；而PCPA模型組大鼠精神萎靡，飲食不振，晝夜節(jié)律恢復(fù)較慢；正常對(duì)照組大鼠生活、睡眠規(guī)律無(wú)明顯變化。實(shí)驗(yàn)前及造模第1天，各組大鼠體質(zhì)量平穩(wěn)增長(zhǎng)，組間無(wú)明顯差異。治療第1天，失眠使大鼠體質(zhì)量顯著下降，除正常對(duì)照組外的各組大鼠體質(zhì)量間無(wú)明顯差異。而治療第7天，各組大鼠平均體質(zhì)量由重至輕依次為正常對(duì)照組、電針療法組、地西泮西藥組及PCPA模型組，組間差異性顯著，其中正常對(duì)照組體質(zhì)量正常增長(zhǎng)，PCPA模型組增長(zhǎng)緩慢，電針療法組、地西泮西藥組經(jīng)治療后體質(zhì)量呈恢復(fù)性增加。

圖1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量變化比較(g)

2.2 大鼠血清SOD活性和MDA含量的變化

表1顯示，與正常對(duì)照組比較，PCPA模型組大鼠血清SOD活性、SOD/MDA值降低(均P<0.05)，MDA含量升高(P<0.05)；地西泮西藥組SOD活性與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但MDA含量、SOD/MDA值分別低于和高于模型組(均P<0.05)；電針療法組SOD活性高于對(duì)照組(P<0.05)，MDA含量、SOD/MDA值與地西泮西藥組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 大鼠血清SOD活性及MDA含量比較

注：與對(duì)照組比較：*P<0.05；與模型組比較：※P<0.05；與地西泮西藥組比較：#P<0.05

2.3 大鼠海馬TUNEL凋亡染色的變化

圖2表2顯示，TUNEL檢測(cè)大鼠海馬區(qū)凋亡情況顯示，正常對(duì)照組的大鼠海馬神經(jīng)元僅出現(xiàn)少量凋亡且分布分散，細(xì)胞凋亡率最低；PCPA模型組的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)量顯著增多且分布密集，細(xì)胞凋亡率最高；地西泮西藥組、電針療法組的大鼠海馬區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞凋亡率較PCPA模型組均明顯降低。

圖2 大鼠海馬TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果

組別正常對(duì)照組PCPA模型組地西泮西藥組電針療法組凋亡率(%)7.56±1.2374.89±5.66?37.84±3.59?※36.19±3.94?※

注：與對(duì)照組比較：*P<0.05；與模型組比較：※P<0.05

2.4 大鼠海馬NeuN和BDNF的mRNA及蛋白表達(dá)情況

表3 大鼠海馬NeuN及BDNF的mRNA及蛋白表達(dá)差異比較

注：與對(duì)照組比較：*P<0.05；與模型組比較：※P<0.05；與地西泮西藥組比較：#P<0.05

表3圖3顯示，與正常對(duì)照組比較，PCPA模型組大鼠海馬中NeuN的mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低(均P<0.05)；與PCPA模型組比較，地西泮西藥組及電針療法組經(jīng)治療能夠顯著提高大鼠海馬中NeuN的mRNA及蛋白表達(dá)，尤以電針療法組表達(dá)水平提升更為明顯(均P<0.05)。各組大鼠海馬中BDNF的mRNA及蛋白表達(dá)情況也同樣符合上述規(guī)律。

圖3 各組大鼠海馬NeuN及BDNF的蛋白表達(dá)條帶

3 討論

失眠癥屬于中醫(yī)“不寐”范疇。不寐發(fā)病機(jī)制主要以五臟功能紊亂為基礎(chǔ)，以五神失守為表現(xiàn)[14]。電針五臟俞治療失眠，是對(duì)失眠發(fā)病機(jī)制全面認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上結(jié)合前期研究結(jié)果制定的[15-16]。五臟俞即肺俞、心俞、肝俞、脾俞、腎俞，其對(duì)五臟功能有直接雙向調(diào)理作用[17]。《素問(wèn)·宣明五氣篇》：“五臟所藏：心藏神，肺藏魄，肝藏魂，脾藏意，腎藏志”，說(shuō)明五臟的生理活動(dòng)與精神情志密切相關(guān)，五臟功能失調(diào)導(dǎo)致精神情志失常，繼而導(dǎo)致不寐的發(fā)生。電針刺激有調(diào)節(jié)外周神經(jīng)、鎮(zhèn)靜作用，使人體腦有所依、神有所歸，在臨床中配合五臟俞可起到很好的寧神安寐之功[18]。本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制PCPA致大鼠失眠經(jīng)典模型，從晝夜不間斷觀察中我們發(fā)現(xiàn)，與PCPA模型組比較，失眠大鼠經(jīng)電針五臟俞治療后精神狀態(tài)、行為活動(dòng)趨于正常，晝夜節(jié)律、體質(zhì)量增速逐漸恢復(fù)，對(duì)大鼠失眠狀態(tài)的整體改觀稍優(yōu)于地西泮西藥組，提示電針五臟俞能促進(jìn)失眠大鼠體內(nèi)生理功能恢復(fù)，改善中樞神經(jīng)活動(dòng)。

觀察各組大鼠海馬TUNEL染色結(jié)果可以看出，相較正常對(duì)照組，PCPA模型組海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡嚴(yán)重、凋亡率最高，而電針療法組神經(jīng)元細(xì)胞相較模型組凋亡程度明顯減輕、凋亡率降低，地西泮西藥組海馬凋亡減弱程度與電針療法組接近。由此電針五臟俞對(duì)失眠大鼠中樞神經(jīng)的調(diào)節(jié)保護(hù)作用得以初步顯現(xiàn)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，通過(guò)針刺背俞穴調(diào)節(jié)植物神經(jīng)，能影響機(jī)體氧化與抗氧化系統(tǒng)平衡[19]。SOD是一種重要的抗氧化劑，外源性補(bǔ)充適量SOD能夠有效清除體內(nèi)過(guò)量氧自由基，延緩細(xì)胞衰老，最終起到防病治療的作用[20]。而病理情況下，SOD活性降低，導(dǎo)致氧自由基過(guò)量聚集，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，形成MDA等脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，損傷生物膜進(jìn)而使細(xì)胞死亡[21]。在本研究中，電針療法組SOD/MDA值高于PCPA模型組和地西泮西藥組，與正常對(duì)照組接近。提示電針五臟俞可通過(guò)促進(jìn)機(jī)體血清SOD活性和降低MDA合成，從而緩解PCPA致失眠引起的氧化應(yīng)激、自由基水平上升、機(jī)體氧化與抗氧化系統(tǒng)紊亂，再次驗(yàn)證電針五臟俞具有促進(jìn)大鼠體內(nèi)生理功能，改善睡眠的效果。肖愛(ài)嬌等研究同樣發(fā)現(xiàn)，熱敏灸具有緩解PCPA所致失眠大鼠癥狀的作用，且能顯著提高機(jī)體SOD活性，降低MDA含量[22]。NeuN是一種穩(wěn)定而敏感的成熟神經(jīng)細(xì)胞特異抗原結(jié)合物，參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、分化和功能，在大部分神經(jīng)細(xì)胞種類(lèi)中表達(dá)，常作為成熟神經(jīng)元存活的主要檢測(cè)指標(biāo)[12]，已被廣泛用于神經(jīng)發(fā)育學(xué)、病理組織診斷學(xué)以及干細(xì)胞臨床研究等領(lǐng)域[23-24]。BDNF是目前為止研究最多的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，其合成于腦，廣泛分布于大腦皮質(zhì)及海馬區(qū)域，BDNF表達(dá)下調(diào)會(huì)損傷神經(jīng)可塑性[25]。本實(shí)驗(yàn)分別在基因和蛋白水平檢測(cè)大鼠海馬NeuN和BDNF的表達(dá)。結(jié)果表明，PCPA模型組大鼠海馬區(qū)NeuN和BDNF的mRNA表達(dá)較正常對(duì)照組顯著下調(diào)，而電針療法組的顯著上調(diào)；蛋白檢測(cè)結(jié)果與mRNA水平檢測(cè)基本一致，且電針組2指標(biāo)變化與西藥組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示PCPA剝奪睡眠會(huì)造成大鼠腦神經(jīng)元的缺失，使神經(jīng)元出現(xiàn)死亡，這可能與內(nèi)源性神經(jīng)再生受到抑制和神經(jīng)元嚴(yán)重?fù)p傷有關(guān)。而通過(guò)針刺五臟俞能顯著促進(jìn)BDNF的釋放，從而間接刺激神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)元的生長(zhǎng)，提高海馬神經(jīng)元內(nèi)NeuN的表達(dá)，且電針組治療效果明顯高于西藥組。以上結(jié)果均表明，電針治療對(duì)失眠后腦神經(jīng)修復(fù)發(fā)揮著重要作用。

綜上所述，筆者認(rèn)為電針五臟俞促進(jìn)體內(nèi)生理功能，改善中樞神經(jīng)活動(dòng)的機(jī)制是通過(guò)內(nèi)部促進(jìn)大鼠海馬區(qū)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF的釋放，從而增加腦內(nèi)能正常表達(dá)NeuN的神經(jīng)元數(shù)目，減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，提高血清SOD活性，下調(diào)MDA含量以緩解PCPA造成的機(jī)體氧化與抗氧化系統(tǒng)紊亂，使大鼠外在精神面貌愈發(fā)轉(zhuǎn)好，晝夜節(jié)律、體質(zhì)量增速愈發(fā)恢復(fù)，進(jìn)而達(dá)到治療失眠的目的。電針五臟俞刺激對(duì)失眠大鼠腦神經(jīng)的修復(fù)損傷和保護(hù)作用稍優(yōu)于常規(guī)西藥地西泮，且電針五臟俞操作簡(jiǎn)便，無(wú)不良反應(yīng)，可使失眠患者擺脫藥物治療煩惱，具有較強(qiáng)的臨床實(shí)用性，適宜臨床推廣。至于電針五臟俞刺激提高海馬區(qū)BDNF及NeuN表達(dá)的機(jī)制仍需進(jìn)一步的深入研究。