王松月，依香叫，李金誠，白穎慧，周 虹，李金波，裴凌鵬Δ

(1. 民族醫(yī)藥教育部重點實驗室，中央民族大學(xué)藥學(xué)院，北京 100081； 2. 悉尼大學(xué)NAZAC研究所， 澳大利亞； 3. 紐約州羅切斯特大學(xué)病理與藥物系，美國)

db/db小鼠是美國Jackson實驗室發(fā)現(xiàn)的位于 4 號染色體的Leptin 受體基因缺陷導(dǎo)致的自發(fā)性 2 型糖尿病小鼠。前期研究表明[1-5]，本品系小鼠于出生4周后就會出現(xiàn)肥胖、高血糖、高血脂、糖尿等一系列糖尿病的癥狀，其生理性與行為性特征與人類2型糖尿病表現(xiàn)極為相似，目前被認(rèn)為是較理想的2型糖尿病(T2DM)研究用動物模型。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，糖尿病屬于“消渴”范疇，本病的基本病機為“本虛標(biāo)實”，主要病位在腎，其次在肺胃等臟腑，肺脾腎氣虛是其發(fā)病基礎(chǔ)，瘀血、水濕、痰濁則為其主要外邪。目前，糖尿病已成為全球范圍內(nèi)的一種重大疑難性疾病，具有高發(fā)病率與并發(fā)癥高致殘率、死亡率等特點。糖尿病關(guān)鍵統(tǒng)計指南預(yù)測，截止2035年全球T2DM患病人數(shù)可能達(dá)到5.92億[6]，而糖脂代謝失調(diào)將造成腎臟組織形態(tài)病變與功能性紊亂，最終引發(fā)慢性腎病，從而促使機體內(nèi)分泌代謝、激素代謝以及鈣吸收等一系列的問題，成為誘發(fā)繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的最主要因素[7]。為此，本實驗旨在針對db/db小鼠生存周期過程的動態(tài)觀測，研究糖代謝紊亂-腎病-骨質(zhì)疏松癥之間的關(guān)系，進(jìn)一步驗證中醫(yī)“腎主骨”理論的科學(xué)性，并為此品系小鼠作為2型糖尿病骨質(zhì)疏松癥模型的可能提供可靠的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級7周齡雄性自發(fā)性2型糖尿病BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/Nju品系的db/db小鼠70只，體質(zhì)量(27.03±1.60)g；基因型(Leprdb)wt/wt的db/m小鼠40只，體質(zhì)量為(15.40±2.34)g，均購自南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院[SCXK(蘇)2015-0001 ]。并全部在中國中醫(yī)科學(xué)研究院清潔級實驗室[SYXK(京)2016-0021 ]進(jìn)行飼養(yǎng)及實驗。

1.2 實驗分組

按照體質(zhì)量隨機分組，模型組(db/db雄性小鼠)和對照組(db/m雄性小鼠)各9組(依據(jù)動態(tài)觀測9個不同時間點，即7、8、9、10、11、12、16、20、24周)，模型組每組包含基因型(Leprdb)mut/mut的db/db小鼠7只，對照組每組包含基因型(Leprdb)wt/wt的db/m小鼠4只，飼養(yǎng)期間給予充足的純凈水，自由攝食，室溫在20～25 ℃之間，明暗交替照射12 h/12 h。

1.3 主要儀器及試劑

Life Scan Europe 生產(chǎn)的Ultra血糖儀及其配套血糖試紙；全自動生化分析儀(日立7020)；電子顯微鏡(日本 Olympus公司)；脫水機(武漢俊杰電子有限公司)；包埋機(武漢俊杰電子有限公司)；病理切片機(上海徠卡儀器有限公司)；組織切片機(浙江金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)；載玻片及蓋玻片(江蘇世泰器材有限公司)；正丁醇、無水乙醇、二甲苯、鹽酸、氨水、中性樹膠(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；HE染液套裝(武漢谷歌生物科技有限公司)；CREA試劑盒、ALP試劑盒(中生北控公司，批號160601與批號160821)；BUN試劑盒(maccura公司，批號0517021)。

1.4 實驗方法

1.4.1 db/db和db/m小鼠的血糖測量 分別于第7、8、9、10、11、12、16、20、24周測定該周齡模型組與對照組的空腹血糖，檢測前將小鼠禁食8 h，經(jīng)尾靜脈取血，用血糖儀測定小鼠的血糖值。

1.4.2 db/db和db/m小鼠的體質(zhì)量測量及樣本采集 分別于第7、8、9、10、12、16、20、24周，測定模型組與對照組的體質(zhì)量；眼球取血法收集血液200 μL，6000 r·h-1，離心15 min后分離血清，于-20 ℃冷凍儲存，后續(xù)按照試劑盒提供的實驗方法，分別檢測血清ALP、BUN、CREA的含量。而后進(jìn)行處死，收集腦、心、肺、肝、腎、睪周脂肪并稱重，計算臟腦系數(shù)(即臟器(或脂肪)質(zhì)量/腦質(zhì)量)。

1.4.3 腎臟、脛骨不同組織病理學(xué)觀察 將不同時間點的模型組與對照組腎臟、脛骨放置于4%多聚甲醛中固定24 h，再次經(jīng)過梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片及HE染色，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 空腹血糖水平

表1顯示，與對照組比較，第7周模型組的所有空腹血糖值升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；從第8周開始模型組空腹血糖值明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 血糖值水平比較

注：與db/m小鼠比較：▲P<0.05

2.2 體質(zhì)量變化

圖1表2顯示，從第7周到第24周，db/db小鼠體質(zhì)量明顯高于db/m小鼠而且增長迅速(P<0.01)，而db/m小鼠體質(zhì)量比較穩(wěn)定并未隨著周齡增長而明顯增高。

表2 體質(zhì)量水平比較

注：與db/m小鼠比較：▲▲P<0.01

2.3 臟腦系數(shù)測定

表3顯示，前期研究表明[8]，絕對器官質(zhì)量可能存在個體間的變異性，而臟腦系數(shù)則可以減少這些可變性，更準(zhǔn)確地反映機體真實狀況。本實驗結(jié)果表明，與對照組比較，第7周開始模型組的心腦系數(shù)、肝腦系數(shù)、肺腦系數(shù)、睪周脂肪腦系數(shù)、腎腦系數(shù)均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

表3 db/db與db/m小鼠的臟腦系數(shù)比較

注：與db/m小鼠比較：▲P<0.05,▲▲P<0.01

2.4 生化指標(biāo)測定

表4顯示，與對照組比較，第8周開始模型組血清CREA、BUN水平有所升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。第12周開始上述水平又明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。而血清ALP水平則呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，在第16周開始其水平較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表4 血清ALP、BUN和CREA水平比較

注：與db/m小鼠比較：▲P<0.05，▲▲P<0.01

注：圖左下為db/m小鼠，圖右上為db/db小鼠圖1 24周齡db/db小鼠與db/m小鼠體型比較

2.5 組織病理學(xué)變化

圖2 8周齡db/db小鼠與db/m小鼠腎組織病理變化

2.5.1 腎組織病理觀察 圖2顯示，8周齡的db/m小鼠腎小球形態(tài)完整，無細(xì)胞核變異，腎小管上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；比較之下，db/db小鼠腎組織切片可見，腎小球基底膜均質(zhì)性增厚，腎小球系膜基質(zhì)增多，腎小囊基底膜增厚。

2.5.2 骨組織病理觀察 圖3顯示，24周齡db/m小鼠骨小梁粗壯，排列整齊，骨小梁密度、面積正常；比較db/db小鼠骨組織切片可見，部分骨小梁變細(xì)，形態(tài)結(jié)構(gòu)不完整，空骨窩增加，骨密度和面積減少。

圖3 24周齡db/db小鼠與db/m小鼠脛骨病理變化

3 討論

前期研究表明[9]，db/m小鼠與db/db小鼠母系相同，且db/m小鼠的體質(zhì)量、血糖一直處于相對正常的水平。因此本次實驗選取db/m小鼠作為對照組，可以更好地觀察db/db小鼠在不同生長周齡的體質(zhì)量、血糖等變化情況。

本實驗通過對db/db小鼠7～24周的連續(xù)動態(tài)監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)在第8周開始db/db小鼠的空腹血糖值明顯升高，至第10周后后續(xù)一直保持在高血糖水平，表明10周齡后本品系小鼠已達(dá)到2型糖尿病血糖值標(biāo)準(zhǔn)。同時，db/db小鼠的體質(zhì)量一直呈現(xiàn)持續(xù)增長狀態(tài)，各臟器組織/腦系數(shù)明顯高于db/m小鼠(P<0.01)，表明db/db小鼠符合自發(fā)肥胖的特征。上述結(jié)果與相關(guān)研究報道及實驗動物提供方的實驗動物模型說明基本一致[10-12]。

隨著db/db小鼠機體糖脂代謝失控，引發(fā)其腎臟組織形態(tài)學(xué)病變，導(dǎo)致功能性紊亂。前期研究表明[13-14]，腎臟排泄功能損害時尿素將在血中滯留，而導(dǎo)致血清BUN、CREA水平增加。本實驗結(jié)果也表明，在空腹血糖持續(xù)升高過程中，自第7周開始db/db小鼠血清BUN、CREA水平有所升高，并在第12周開始與對照組差異顯著，說明db/db小鼠可能出現(xiàn)了嚴(yán)重的腎臟排泄功能損傷。相比之下，血清ALP的變化則呈現(xiàn)“先降低后升高”的趨勢。究其原因可能是由于高血糖而引起滲透性利尿，導(dǎo)致鎂離子的丟失，同時尿糖增加又會讓鎂離子在腎小管的重吸收受到抑制，進(jìn)而加重血漿鎂離子減少。而鎂離子作為ALP的激活劑，其含量的降低則會引起血清ALP的降低[15]，故在糖尿病前期血漿中的ALP先呈現(xiàn)降低趨勢；隨著糖尿病病情發(fā)展，其引發(fā)的脂類代謝障礙，造成肝臟受損，加之骨吸收程度增強，其變化逐漸呈現(xiàn)急速升高趨勢，實驗結(jié)果表明，血清ALP自第16周開始與對照組比較出現(xiàn)明顯升高，差異顯著(P<0.05)。與此同時，隨著骨形成-骨吸收失衡加劇，結(jié)合不同時間脛骨骨組織病理觀察，發(fā)現(xiàn)第24周開始出現(xiàn)骨小梁變細(xì)、形態(tài)結(jié)構(gòu)不完整、間隙增大等現(xiàn)象和病理學(xué)變化。

綜上所述，db/db小鼠先在第8周出現(xiàn)腎臟組織形態(tài)病變與輕度功能性失調(diào)，至第12周出現(xiàn)腎臟功能嚴(yán)重?fù)p傷，而后在第16周出現(xiàn)骨代謝紊亂，第24周出現(xiàn)骨小梁結(jié)構(gòu)的改變，誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。再次驗證了腎中精氣虛少，骨髓化源不足，骨不能得到髓的滋養(yǎng)，從而引起骨髓空虛，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的中醫(yī)論斷。故此，利用db/db小鼠作為進(jìn)一步探索2型糖尿病腎與骨之間的關(guān)系以及糖尿病骨質(zhì)疏松癥的可行性模型提供了很好的依據(jù)。