曹敏玲， 池曉玲， 蔣俊民， 唐永煌， 周粵湘

1.廣東省中醫(yī)院肝病科，廣東 廣州 510120； 2.華僑醫(yī)院； 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)

解放軍傳染病研究所對(duì)1 740例慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者對(duì)替諾福韋酯(TDF)耐藥可能相關(guān)突變位點(diǎn)進(jìn)行分析[1]，目的是通過大樣本測(cè)序分析CHB患者HBV反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase, RT)序列，明確TDF耐藥可能相關(guān)的突變?cè)谖覈颊呶词褂迷撍幥暗臋z出狀況，預(yù)測(cè)TDF在我國臨床的應(yīng)用前景。通過收集1 740例CHB患者血清，提取血清中的HBV DNA，采用巢式PCR方法擴(kuò)增HBV RT基因，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序，NTI軟件比對(duì)結(jié)果。檢測(cè)與核苷(酸)類似物耐藥的相關(guān)RT區(qū)12個(gè)位點(diǎn)測(cè)序，重點(diǎn)分析與TDF臨床耐藥可能相關(guān)的A194T突變及體外證實(shí)可降低TDF活性的V214A、Q215S和A181V+N236T突變。結(jié)果顯示，540例(31%)患者分別檢測(cè)出了拉米夫定(LAM)、阿德福韋酯(ADV)、恩替卡韋(ETV)和替比夫定(LdT)耐藥相關(guān)突變；未檢出A194T突變；34例(2.0%)患者檢出V214A突變；3例(0.2%)患者檢出Q215S突變，15例(0.9%)患者檢出A181V+N236T(其中3例為A181V/T+N236T)突變。最終未檢出與TDF臨床耐藥可能相關(guān)的A194T突變，提示我國目前CHB患者自然發(fā)生或應(yīng)用核苷(酸)類似物后引起的TDF原發(fā)耐藥的可能性很小，預(yù)測(cè)該藥在我國治療對(duì)4種抗HBV核苷(酸)類似物耐藥的患者應(yīng)具有較好療效。但截至2018年8月，國內(nèi)暫未出現(xiàn)TDF耐藥案例。

本文介紹了1例40歲的HBeAg陰性CHB男性患者接受TDF 300 mg/d治療，初始HBV定量基線水平較低，在治療后6個(gè)月無法檢測(cè)。然而，在TDF治療12個(gè)月后出現(xiàn)反彈。我們?cè)噲D找到與病毒學(xué)突破相關(guān)的突變位點(diǎn)，最終雙中心耐藥基因分析結(jié)果顯示未找到突變位點(diǎn)。本文在最后也對(duì)患者TDF應(yīng)答不佳的情況進(jìn)行確認(rèn)，并對(duì)造成TDF應(yīng)答不佳的幾種因素進(jìn)行分析，以供業(yè)界參考。

1 病例

患者,男，40歲,廣東工業(yè)大學(xué)教師，1998年體檢發(fā)現(xiàn)澳抗陽性，2016年5月體檢發(fā)現(xiàn)AFP升高，入住中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院查AFP：1 654 ng/ml；腹部CT：肝S1/8不規(guī)則腫塊(29 mm×25 mm)，考慮肝癌，侵犯門脈主干、門脈左支及其分支并腫物形成，侵犯下腔靜脈肝段、肝中靜脈；2016年6月13日查AFP：1 654 ng/ml，HBV DNA定量：2 170 IU/ml；影像學(xué)確診肝惡性腫瘤，于中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院行TACE術(shù)控制腫瘤，術(shù)程順利，6月27日出院。2016年7月18日復(fù)查影像學(xué)提示腫瘤無縮小，復(fù)查AFP：4 450 ng/ml，HBV DNA定量：570 IU/ml；開始口服TDF(韋瑞德)抗病毒，甲磺酸阿帕替尼片(艾坦，0.5 g 口服 1次/d)控制腫瘤。2016年7月27日至2016年10月12日AFP從4 801 ng/ml下降至434.7 ng/ml。2017年1月17日復(fù)查AFP 2 983 ng/ml；上腹部MR增強(qiáng)提示腫瘤進(jìn)展，停艾坦，改服索拉菲尼(印度Nactco，400 mg口服，1次/d)，TDF繼續(xù)用藥，2017年2月15日至5月2日AFP從7 801 ng/ml上升至13 145 ng/ml，4月10日MR提示腫瘤進(jìn)展，停用索拉菲尼。2017年5月13日行肝動(dòng)脈灌注化療(TAI),過程順利，5月13日下午出院，5月14日重新口服索拉菲尼。2017年6月5日、6月22日、7月28日先后行TAI，手術(shù)期間停服索拉菲尼2 d，術(shù)后正常服用，TDF未停服。2017年8月17日MR增強(qiáng)提示腫瘤進(jìn)展，停用索拉菲尼。2017年9月1日改用瑞戈菲尼(德國拜耳，160 mg口服 1次/d)，因副作用大，10 d后停藥。10月28日AFP下降至27 662 ng/ml。2017年11月2日、11月16日于廣州市腫瘤醫(yī)院注射納武單抗(opodivo，180 mg，香港購)；2017年11月2日HBV DNA定量1.13E3 IU/ml。2017年11月16日復(fù)查AFP上升至30 629 ng/ml；HBV DNA定量1.13E3 IU/ml；2017年11月30日因膽紅素升高行膽管支架手術(shù)，12月1日HBV DNA定量1.76E3 IU/ml；2017年12月13日出院，出院后護(hù)肝治療，膽紅素由86.4 mmol/L下降至37.2 mmol/L。2018年1月9日復(fù)查AFP 121 000 ng/ml，開始口服樂伐替尼(Lenvima，10 mg 口服，每晚1次，香港購)至死亡前1個(gè)月。2018年1月10日開始入住廣東省中醫(yī)院肝病科。2018年1月28日HBV DNA定量檢測(cè)：3.02E2 IU/ml；入院后反復(fù)復(fù)查HBV定量均陽性，2 000～30 000 IU/ml，雙檢驗(yàn)中心對(duì)患者血樣進(jìn)行多次耐藥基因分析，均未能檢測(cè)出耐藥位點(diǎn)。后因肝癌病情進(jìn)展迅速于2018年3月1日去世。

2 討論

2.1 TDF應(yīng)答不佳的確認(rèn)既往國內(nèi)外不同的CHB指南對(duì)核苷(酸)類似物抗病毒治療的應(yīng)答不佳采用了不同的定義。綜合考慮核苷(酸)類似物治療早期病毒學(xué)下降既往國內(nèi)外不同的CHB指南對(duì)核苷(酸)類似物抗病毒治療的應(yīng)答不佳采用了不同的定義。綜合考慮核苷(酸)類似物治療早期病毒學(xué)下降。HBV耐藥評(píng)估：對(duì)于核苷(酸)類似物治療24周HBV DNA仍未轉(zhuǎn)陰，尤其是治療期間出現(xiàn)病毒學(xué)反跳患者，可考慮進(jìn)行HBV耐藥檢測(cè)。對(duì)于明確的HBV耐藥患者，應(yīng)根據(jù)患者所用核苷(酸)類似物種類及治療期間HBV DNA動(dòng)態(tài)變化等情況相應(yīng)調(diào)整抗病毒治療方案。對(duì)于ETV/TDF應(yīng)答不佳患者，如基線HBV DNA≥1.0×108IU/ml，推薦加用無交叉耐藥的核苷(酸)類似物聯(lián)合抗病毒治療；如患者基線HBV DNA<1.0×108IU/ml，推薦原方案治療至48周再評(píng)估(B1)。 根據(jù)專家共識(shí)，本例患者用藥24周后檢測(cè)病毒定量陰性，48周后病毒定量重新檢測(cè)，患者為TDF初治，雙中心(廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)中心/金域檢驗(yàn)中心)檢測(cè)對(duì)HBV定量及耐藥基因分析進(jìn)行了多次重復(fù)檢測(cè)，均提示病毒學(xué)反跳，但均未發(fā)現(xiàn)耐藥位點(diǎn)，雖患者依從性極好，但臨床仍考慮TDF應(yīng)答不佳。

2.2 TDF常見耐藥位點(diǎn)及本次檢測(cè)位點(diǎn)對(duì)比2018年韓國一個(gè)疑似TDF耐藥案例報(bào)道中提到[2]，在經(jīng)過43周連續(xù)治療的單純CHB使用TDF初治患者血樣中進(jìn)行全基因測(cè)序，可以被檢測(cè)到的可疑耐藥位點(diǎn)有11個(gè)，可疑位點(diǎn)為rtY9H、rtL91I、rtS106C、rtS106G、rtT118C、rtT118G、rtQ267L、rtI269L、rtA317S、rtK333Q、rtN337H，但該病例只有1例，所檢出耐藥位點(diǎn)無對(duì)比性。既往全世界關(guān)于TDF耐藥的病例研究里面[3-6]，HIV合并HBV使用TDF耐藥位點(diǎn)是rtA194T、rtL180M、rtM204V[23-25]。金域檢驗(yàn)中心檢測(cè)HBV核苷類似物耐藥包括常見的相關(guān)21個(gè)位點(diǎn)，包括rt80、rt84、rt85、rt169、rt173、rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt207、rt213、rt214、rt215、rt229、rt233、rt236、rt237、rt238、rt250；同時(shí)檢測(cè)HBV相關(guān)的9個(gè)基因型，具體為HBV A-H型及HBV C/D重組型。局限性：當(dāng)病毒突變株<10%時(shí)，本方法難以檢出，報(bào)告為陰性。EASL 2017指南提出TDF主要耐藥位點(diǎn)為rt181及rt236(見表1)。本例患者在金域中心送檢樣本檢測(cè)位點(diǎn)包含rtA194T、rtL180M、rtM204V、rt181及rt236等幾個(gè)常見耐藥位點(diǎn)，但均未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。由圖1可見，我院檢驗(yàn)中心對(duì)8個(gè)常見位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，可檢測(cè)出HBV，但未見突變位點(diǎn)，考慮為野生株。TDF作為一個(gè)無環(huán)核苷酸，具有更強(qiáng)大的抗病毒活性，在3年時(shí)間內(nèi)未見耐藥病例。在服藥時(shí)間上，患者作為高校教師，治療非常積極，依從性極強(qiáng)，規(guī)律服藥1年出現(xiàn)病毒學(xué)突破，根據(jù)既往TDF數(shù)據(jù)，1年內(nèi)耐藥可能性極低。故經(jīng)多學(xué)科討論,本例患者更偏向于野生株病毒對(duì)TAF應(yīng)答不佳。

表1 常用核苷類似物耐藥位點(diǎn)分布(EASL 2017)Tab 1 Distribution of nucleoside analogue resistance site (EASL 2017)

2.3 TDF應(yīng)答不佳可疑原因分析

2.3.1 TDF應(yīng)答不佳可能與腫瘤進(jìn)展相關(guān)：腫瘤免疫反應(yīng)以細(xì)胞免疫為主，體液免疫為輔。參加細(xì)胞免疫的效應(yīng)細(xì)胞主要有細(xì)胞毒性T細(xì)胞CTL、NK及巨噬細(xì)胞。CTL被白細(xì)胞介素2(IL-2)激活后可以通過其T細(xì)胞上的人類主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility compolex, MHC)Ⅰ型分子而釋放。CTL的保護(hù)作用在對(duì)抗病毒所致的腫瘤(如EBV引起的伯基特淋巴瘤和HPV導(dǎo)致的腫瘤)時(shí)特別明顯，不需要預(yù)先致敏的、能殺傷腫瘤細(xì)胞的淋巴細(xì)胞[7-8]。由IL-2激活后，NK細(xì)胞可以溶解多種人體腫瘤細(xì)胞不引起T細(xì)胞的免疫反應(yīng)，因此，NK細(xì)胞是抗腫瘤免疫的第一線抵抗力量。NK細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞的機(jī)制是細(xì)胞受體和抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC)。巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞起到協(xié)同作用：T細(xì)胞產(chǎn)生的α-干擾素可激活巨噬細(xì)胞,而巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤壞死因子代謝產(chǎn)物在溶解瘤細(xì)胞中起主要作用。體液免疫參加抗腫瘤反應(yīng)的機(jī)制主要是激活補(bǔ)體和介導(dǎo)NK細(xì)胞參加抗腫瘤免疫的細(xì)胞效應(yīng)。在腫瘤不斷進(jìn)展的過程中，細(xì)胞免疫的效應(yīng)細(xì)胞和體液免疫的補(bǔ)體均會(huì)被“分流”，特別是對(duì)抗病毒的CTL因消耗過度無法參與HBV的滅活，同時(shí)，由于腫瘤進(jìn)展引起免疫系統(tǒng)的崩塌，讓HBV逃逸免疫反應(yīng),產(chǎn)生病毒學(xué)突破,創(chuàng)造更適合的體內(nèi)環(huán)境。從圖2～3得知，HBV DNA的波動(dòng)與AFP具有明顯的相關(guān)性，卻與ALT波動(dòng)無明顯相關(guān)性。這表明，在腫瘤進(jìn)展中，HBV DNA同時(shí)也發(fā)生了病毒學(xué)突破。

圖1 患者耐藥位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果Fig 1 Test results of drug resistance sites for the patient

2.3.2 TDF應(yīng)答不佳可能與膽汁淤積相關(guān)：TDF是口服藥物。膽汁淤積會(huì)引起消化不良和腹脹、腹瀉。不僅導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)吸收障礙，而且導(dǎo)致部分藥物的吸收障礙[9]。膽汁排泄不暢將導(dǎo)致膽囊壁肥厚和發(fā)炎。造成膽汁排泄不暢，一方面影響某些經(jīng)膽汁排泄藥物的消除過程，另一方面也影響多數(shù)具有腸肝循環(huán)藥物的再吸收作用，必將影響相關(guān)藥物的療效。從圖4也可看出，在膽紅素發(fā)生第一次驟升時(shí)，患者也同時(shí)發(fā)生了病毒學(xué)突破。

2.3.3 TDF應(yīng)答不佳可能與不同類別靶向抗腫瘤藥物相關(guān)：與其他單克隆抗體相似，能特異性地阻斷細(xì)胞內(nèi)支配凋亡、增殖、分化的主要下游信號(hào)途徑。抑制細(xì)胞周期；間接抑制腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖; 促進(jìn)細(xì)胞凋亡。另外，可通過抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)及補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒效應(yīng)，起到殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。靶向治療作用的位點(diǎn)是細(xì)胞癌變過程中的基因、受體和信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵酶，這些關(guān)鍵酶又可能TDF抗病毒藥效所共有，使藥物無法發(fā)揮抗病毒療效。從圖5可見，患者在使用瑞戈菲尼及納武單抗期間仍可檢出HBV，在樂伐替尼治療期間出現(xiàn)了HBV定量進(jìn)行性升高，但在原始肝癌靶向藥物索拉菲尼敏感期，HBV控制在不可檢測(cè)范圍。不同類別的靶向抗腫瘤藥物可能與抗病毒藥物之間存在著干擾作用。

圖2 HBV DNA定量與AFP波動(dòng)情況；圖3 HBV DNA定量與ALT波動(dòng)情況；圖4 HBV DNA定量與TBIL波動(dòng)情況；圖5 HBV DNA定量與用藥情況Fig 2 Changes in HBV quantification and AFP; Fig 3 Changes in HBV quantification and ALT; Fig 4 Changes in HBV quantification and TBIL; Fig 5 Changes in HBV quantification and medication

2.4 亮點(diǎn)

2.4.1 病例特征：本例患者最終因肝癌去世，在生命的最后3個(gè)月里，他堅(jiān)定陳述口服TDF的規(guī)律性及劑量標(biāo)準(zhǔn)性，并多次希望我們能分享他的病歷，作為高校教師，他也查詢過國內(nèi)外文獻(xiàn)，認(rèn)為本例病例的特殊性及罕見性，多次配合留取血樣，希望能為科學(xué)進(jìn)步盡最后一點(diǎn)貢獻(xiàn)。另外他也提出捐贈(zèng)器官的要求，最后請(qǐng)紅十字會(huì)鑒定后，因疾病本身無法完成捐獻(xiàn)器官意愿，作為主管醫(yī)師沒能幫他達(dá)成最后愿望表示無比遺憾。

2.4.2 臨床診斷：患者為CHB初治，在口服TDF 1年后發(fā)生HBV DNA病毒學(xué)突破，兩個(gè)不同醫(yī)院(廣東省中醫(yī)院、中山腫瘤醫(yī)院)的檢驗(yàn)中心進(jìn)行熒光PCR定量均證實(shí)病毒可測(cè)出(中山腫瘤醫(yī)院：熒光定量PCR法，cobas Z480熒光定量PCR儀；廣東省中醫(yī)院HBV DNA檢測(cè)方法：熒光探針法，ABI7500熒光定量PCR儀),為診斷應(yīng)答不佳提供充分依據(jù)。

2.4.3 實(shí)驗(yàn)室診斷：廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)中心與金域檢驗(yàn)中心同期進(jìn)行耐藥基因分析結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)，所檢測(cè)的突變位點(diǎn)全部包含國際上已發(fā)布的關(guān)于TDF常見耐藥位點(diǎn)。最終多學(xué)科討論考慮乙肝病毒學(xué)突破原因?yàn)門DF應(yīng)答不佳。

2.4.4 經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn)：盡管最后我們嘗試停用TDF，更換恩替卡韋，但患者腫瘤病情進(jìn)展迅速，乃至不治?；诓±奶厥庑约昂币娦裕覀冄?qǐng)了藥學(xué)部、腫瘤科、檢驗(yàn)科及外院專家唐永煌教授來院進(jìn)行病例大討論，得出本例TDF應(yīng)答不佳的幾個(gè)可能原因，希望提供更多TDF的臨床經(jīng)驗(yàn)。