孫穎昊， 李 驥， 舒慧君， 李智立， 錢家鳴

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科，北京100730；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物物理及結(jié)構(gòu)生物學(xué)系

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一種慢性腸道炎癥性疾病，包括克羅恩病(Crohn’s disease, CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)，臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的腹痛、腹瀉、黏液血便等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。近年來，我國IBD患病率逐漸升高[2-3]，無論國內(nèi)外指南均指出治療方案的選擇需建立在對病情進(jìn)行全面評估的基礎(chǔ)上，主要根據(jù)病情的嚴(yán)重程度和病變累及的范圍制定治療方案[4-5]。當(dāng)前用于UC和CD疾病活動評估的指標(biāo)分別包括臨床活動度評分(改良Mayo評分和簡化CDAI評分)、內(nèi)鏡下評分(Mayo內(nèi)鏡評分和SES-CD)、血清學(xué)指標(biāo)(CRP、CRP/ALB)及糞鈣衛(wèi)蛋白等，但上述指標(biāo)均有優(yōu)劣之處。臨床上仍需發(fā)掘更有價值的新的生物學(xué)標(biāo)志物，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究則是一把解決此問題的利刃。新型循環(huán)免疫炎癥相關(guān)蛋白復(fù)合物(immunoinflammation-related protein complexes, IIRPCs)是人血清中的一種蛋白復(fù)合物，其主要成分是一些與免疫系統(tǒng)、炎癥系統(tǒng)和補(bǔ)體系統(tǒng)相關(guān)的蛋白質(zhì)，既往研究表明，其在健康人群中含量較低，在腫瘤性疾病中含量升高[6]。本研究旨在探討血清IIRPCs水平在IBD疾病活動度評估中的價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象納入2012年11月至2016年5月于北京協(xié)和醫(yī)院門診或住院部就診的69例UC患者和67例CD患者。IBD診斷符合2012年炎癥性腸病診斷及治療共識意見[4]。健康對照者需無明確消化系統(tǒng)腸道疾病、無消化系統(tǒng)及其他系統(tǒng)惡性腫瘤病史、無自身免疫病史。該研究獲北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(S-K462)。

1.2 資料收集通過北京協(xié)和醫(yī)院病案室和住院電子病歷系統(tǒng)，查閱門診及住院病案資料，收集患者臨床資料。IBD患者記錄基本信息(性別、年齡、發(fā)病年齡、病程、既往史、個人史、家族史)，完整診斷(Montreal分型)，臨床活動度評估(CD患者采用HBI指數(shù)進(jìn)行活動度評估[7]，UC患者采用改良Mayo評分[8])，實(shí)驗(yàn)室檢查和結(jié)腸鏡檢查結(jié)果。對于CD患者，緩解期定義為HBI指數(shù)≤4分，>4分為活動期，其中5～8分為中度活動期，≥9分為重度活動期。對于UC患者，緩解期定義為改良Mayo評分≤2分且無單個分項(xiàng)評分>1分，否則為活動期，其中3～5分為輕度活動，6～10分為中度活動，11～12分為重度活動。

1.3 標(biāo)本收集與儲存收集患者臨床檢驗(yàn)后剩余標(biāo)本(實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)結(jié)果與IIRPCs測量血清為同一日采集)，4 ℃ 3 000 r/min離心5 min，吸取上層血清樣本分裝至1.5 ml Eppendorf 管(EP管)中，將分裝標(biāo)記好的血清儲存于-80 ℃低溫冰箱中備用,使用過程中避免反復(fù)凍融。

1.4 血清蛋白電泳為驗(yàn)證每次電泳結(jié)果的可靠性和一致性，隨機(jī)選取6個樣本，每個樣本取200 μl放在一起混勻，制備混合血清作為質(zhì)量控制樣本(qualitycontrol，QC)。將混合血清分裝至600 μl Eppendorf管(EP 管)中，每管100 μl。實(shí)驗(yàn)過程中保障每管QC樣本凍融次數(shù)<5次。

按照實(shí)驗(yàn)室先前建立的Native-PAGE電泳的方法。采用4%～10%的梯度分離膠，由梯度混勻器制備。分離膠凝固后覆蓋4%濃縮膠，每塊膠有12個上樣孔。電泳前將2 μl血清樣本和8 μl 1×上樣緩沖液(用超純水稀釋10×上樣緩沖液至1×)混合后，加入至上樣孔。每塊凝膠中可加10個樣本，其中包含一個QC樣本。玻璃板參數(shù)：寬12 cm，長14 cm，厚度為1.5 mm。電泳參數(shù)：恒流，每塊膠10 mA，持續(xù)1.5 h后，調(diào)整電流為每塊膠25 mA，3 h后終止電泳。后3 h需要加入冷循環(huán)水控溫。電泳結(jié)束后，利用考馬斯亮藍(lán)G-250進(jìn)行染色過夜，然后用二級水進(jìn)行脫色。

1.5 血清IIRPCs定量分析既往研究表明，人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白相關(guān)蛋白復(fù)合物(transferrin-related protein complexes,TRPC)的含量相對穩(wěn)定，在數(shù)千人群樣本中的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，血清TRPC含量與性別、年齡、IIRPCs類型、疾病或健康狀態(tài)無關(guān)，因而可作為穩(wěn)定的內(nèi)參[6]。QC樣本則作為外參，確保每次電泳結(jié)果的一致性。使用TRPC含量對血清樣本的IIRPCs含量進(jìn)行相對定量。利用Umax Powerlook 2100XL Scanner凝膠掃描儀掃描凝膠，圖片存儲為.tiff格式。根據(jù)凝膠條帶，將樣本分為不同的IIRPCs類型(見圖1)。將凝膠圖導(dǎo)入Quantity One軟件(版本4.6.3，美國BioRad公司)，分析每例樣本中IIRPCs的相對含量。在每塊凝膠中，利用QC樣本的TRPC含量對血清樣本的TRPC含量進(jìn)行相對定量。血清樣本的TRPC含量為QC樣本TRPC含量的80%～120%認(rèn)為電泳結(jié)果可靠。將血清樣本的TRPC含量歸一化為100，獲得相對定量血清IIRPCs的含量。每一例樣本IIRPCs相對含量計(jì)算公式為待分析蛋白復(fù)合物條帶光密度值除以該樣本的TRPC光密度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0軟件(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用χ2檢驗(yàn)比較各組間性別和臨床資料差異，用完全隨機(jī)方差分析或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較各組間年齡差異。實(shí)驗(yàn)中各組間差異采用One-way ANOVA的Bonferroni進(jìn)行兩兩比較。所有檢驗(yàn)均為雙邊檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Pearson及Spearman法進(jìn)行相關(guān)性分析。采用受試者工作特性曲線(receiver operator characteristic curve,ROC curve)分析各指標(biāo)對預(yù)測疾病活動度的效力，并劃分最佳閾值分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況69例UC患者中，男43例，女26例，男女比例為1.7∶1，中位年齡45歲(20～73歲)，其中12例處于緩解期，57例處于活動期(輕度活動期6例，中度活動期29例，重度活動期22例)。67例CD患者中，男45例，女22例，男女比例為2∶1，中位年齡32歲(17～59歲)，其中緩解期30例，中度活動期25例，重度活動期5例，另7例CD患者資料不全，未進(jìn)行活動度評估。處于緩解期和活動期患者的年齡、男性所占比例差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

基于血清IIRPCs，所有樣本可分為四類：類型a、b、c和其他類型，其中a型包括a1、a2、a3、a4，4個IIRPCs，b型包括b1、b2、b3、b4、b5，5個IIRPCs，c型為空白型，不含IIRPCs。a型和b型血清IIRPCs見圖1。UC患者中a型36例，b型27例，c型6例；CD患者中a型26例，b型28例，c型8例，其他類型5例。由于其他類型樣本數(shù)目較少，且條帶a1、b1與上方無意義條帶距離較近，定量時容易受到干擾，后續(xù)僅對a型(a2～a4)和b型(b2～b5)IIRPCs進(jìn)行定量分析。

2.2 UC患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)、IIRPCs與疾病活動度關(guān)系活動期UC患者較緩解期UC患者白蛋白(ALB)水平下降，血小板(PLT)、血沉(ESR)和hsCRP水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?；顒悠诨颊逫IRPCs水平較緩解期升高，其中中度活動期b型的b2、b4、b5水平與緩解期相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。重度活動期a型的a3及b型的b2、b5水平與緩解期相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。b2、b5對UC疾病活動度評估的ROC曲線下面積分別為0.826、0.859，略高于HGB、PLT、ESR、hsCRP。各指標(biāo)對UC疾病活動度評估的價值詳見表2。

圖1 a型與b型IIRPCs Native-PAGE電泳結(jié)果

表1 緩解期和活動期UC患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及IIRPCs比較Tab 1 Comparison of laboratory markers and IIRPCs in patients with UC during remission and active stage

注：P值為活動期組與緩解期組比較，IIRPCs值為相應(yīng)條帶與TRPC比值×100。

表2 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及IIRPCs判斷UC臨床疾病活動度的價值Tab 2 Value of laboratory markers and IRPPCs in judging disease activity of UC patients

2.3 CD患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)、IIRPCs與疾病活動度關(guān)系對于CD患者，活動期較緩解期HGB、ALB水平下降，PLT、ESR水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?；顒悠贗IRPCs水平較緩解期呈升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表3)。各實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)對CD疾病活動度評估的價值見表4。

2.4 IIRPCs與臨床常用炎癥指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性分析在UC患者中，以含量較高的a3和b4為例，分析IIRPCs含量是否與臨床常用炎癥指標(biāo)，如ESR、hsCRP存在相關(guān)性。統(tǒng)計(jì)研究a3與ESR及hsCRP，b4與ESR及hsCRP的相關(guān)性，結(jié)果顯示,a3與ESR、a3與hsCRP、b4與ESR呈正相關(guān)(見圖2)。

3 討論

蛋白質(zhì)是生物體功能的直接執(zhí)行者，但并非單個蛋白質(zhì)或幾個蛋白質(zhì)去完成一系列生理功能，通常，蛋白質(zhì)在體內(nèi)與蛋白質(zhì)或其他分子相互作用，形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，通過復(fù)合物執(zhí)行各項(xiàng)生理功能。血液所包含的蛋白質(zhì)與生物體的功能執(zhí)行及疾病的發(fā)生、發(fā)展有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，伴隨著蛋白質(zhì)分離、純化和鑒定技術(shù)的成熟，通過比較正常和不同疾病狀態(tài)下的蛋白質(zhì)的變化，尋找疾病標(biāo)志物已成為新的研究熱點(diǎn)。與單一蛋白質(zhì)相比，蛋白質(zhì)復(fù)合物作為疾病標(biāo)志物有著更貼近生理狀態(tài)的優(yōu)點(diǎn)，同時也降低了對蛋白質(zhì)分離程度的要求，有著更為廣闊的應(yīng)用前景。我們前期研究中首次將蛋白復(fù)合物用于IBD的研究，使用簡單的Native-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了IBD患者血清IIRPCs水平較健康對照明顯升高，IIRPCs能夠作為高靈敏性的IBD診斷生物標(biāo)志物。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，IIRPCs與IBD疾病活動度相關(guān)，活動期IBD患者血清IIRPCs水平較緩解期升高。b2>56.4評估UC活動的靈敏性和特異性分別為73.9%和100%，b5>67.2評估UC活動的靈敏性和特異性分別為82.6%和100%，兩者ROC曲線下面積高于HGB、PLT、ESR、hsCRP。

表3 緩解期和活動期CD患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及IIRPCs比較Tab 3 Comparison of laboratory markers and IIRPCs in patients with CD during remission and active stage

注：P值為活動期與緩解期組間比較，IIRPCs值為相應(yīng)條帶與TRPC比值×100。

表4 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)評估CD疾病活動度的價值Tab 4 Value of laboratory markers in judging disease activity of CD patients

圖2 相關(guān)性分析 A：UC患者a3與ESR相關(guān)性分析(r=0.576，P<0.001)；B：UC患者a3與hsCRP相關(guān)性分析(r=0.392，P=0.020);C:UC患者b4與ESR相關(guān)性分析(r=0.426，P=0.027)；D：UC患者b4與hsCRP相關(guān)性分析(r=0.375，P=0.054)Fig 2 Correlation analysis A: correlation analysis between a3 and ESR in UC patients (r=0.576，P<0.001); B: correlation analysis between a3 and hsCRP in UC patients (r=0.392，P=0.020); C: correlation analysis between b4 and ESR in UC patients (r=0.426, P=0.027); D: correlation analysis between b4 and hsCRP in UC patients (r=0.375,P=0.054)

IIRPCs是血清中多種與炎癥相關(guān)的蛋白分子由非共價鍵相互作用組成的蛋白復(fù)合物，主要成分包括補(bǔ)體因子H，補(bǔ)體C3、C4、C7組分，觸珠蛋白，免疫球蛋白α、γ、κ組分，載脂蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白等，大多與免疫、炎癥和補(bǔ)體系統(tǒng)有關(guān)。補(bǔ)體系統(tǒng)不僅能夠幫助機(jī)體檢測和清除細(xì)菌，而且在維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用。研究表明，葡聚糖硫酸鈉(dextran sulphate sodium salt,DSS)誘導(dǎo)的慢性結(jié)腸炎小鼠模型中結(jié)腸黏膜C3蛋白表達(dá)增加，提示Toll樣受體4(Toll like receptor 4,TLR4)-C3軸可能在腸道免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用[9]。兒童IBD患者的研究提示，補(bǔ)體C4基因數(shù)與炎癥水平呈正相關(guān)，其機(jī)制可能為C4B基因拷貝數(shù)增加，補(bǔ)體系統(tǒng)對微生物的反應(yīng)增強(qiáng)，從而加劇了IBD相關(guān)的微生態(tài)菌群失調(diào)[10]。觸珠蛋白是一種具有免疫調(diào)節(jié)特性的血紅蛋白結(jié)合蛋白，其基因(16q22)具有兩個不同等位基因：觸珠蛋白1和觸珠蛋白2。通過檢測不同人群的觸珠蛋白[4]基因型，發(fā)現(xiàn)CD和UC患者Hp2基因型出現(xiàn)率較高，提示觸珠蛋白基因可能參與IBD易感性[11]。

傳統(tǒng)的炎癥生物學(xué)標(biāo)志物，如CRP、ESR、PLT、PCT等，因檢測簡易快速、無創(chuàng)安全等優(yōu)勢在臨床中普遍使用，但因受全身因素的影響波動較大，靈敏性和特異性欠佳，不能準(zhǔn)確評估IBD活動度[12]。目前已有多項(xiàng)研究表明，活動期IBD患者與緩解期IBD患者血清蛋白質(zhì)組存在差異。KANMURA等[13]使用蛋白芯片系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)活動期UC患者血漿人中性粒細(xì)胞肽1-3(human neutrophil peptides 1-3, HNP 1-3)水平較緩解期UC患者、CD患者、感染性腸炎患者顯著升高，可作為UC活動的指標(biāo)。國外有研究表明，活動期CD患者血清觸珠蛋白水平升高，且與CDAI評分具有較好的一致性[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，IIRPCs與IBD疾病疾病活動度相關(guān)，無論UC還是CD患者，活動期患者血清IIRPCs水平較緩解期升高，且IIRPCs含量與ESR、hsCRP均呈正相關(guān)。血清蛋白質(zhì)組有望成為IBD疾病活動度評估的新方法。

本研究具有一定的局限性。首先，研究樣本量偏小，尤其是重度CD患者數(shù)目較少，雖活動期CD患者血清IIRPCs水平較緩解期呈升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且本研究非前瞻性研究，有待在更大規(guī)模的樣本中進(jìn)行驗(yàn)證。其次，本研究未對蛋白復(fù)合物進(jìn)行進(jìn)一步分離和精確鑒定，同樣的蛋白復(fù)合物在不同疾病中各組分比例、蛋白糖基化修飾可能不同。下一步可增加樣本量，進(jìn)一步分析活動期與緩解期IBD患者血清IIRPCs中不同組分的比例、糖基化修飾等的差異，進(jìn)一步探索IIRPCs在IBD研究中的應(yīng)用價值。

本研究證實(shí)，可利用簡單的Native-PAGE方法，分離疾病相關(guān)的血清IIRPCs。IIRPCs與IBD疾病活動度相關(guān)，活動期IBD患者血清IIRPCs水平較緩解期升高，且IIRPCs含量與傳統(tǒng)炎癥指標(biāo)ESR、hsCRP均呈正相關(guān)。關(guān)于IIRPCs的進(jìn)一步研究，將會給發(fā)掘更佳的生物學(xué)標(biāo)志物提供方向。