晉 松, 金 杰, 吳 克

(合肥學(xué)院 生物與環(huán)境工程系 安徽省環(huán)境污染防治與生態(tài)修復(fù)協(xié)同創(chuàng)新中心, 合肥 230601)

四氯乙烯(Tetrachloroethylene，PCE，又名全氯乙烯)，是一種常見的氯代烴類衍生物，因其具有優(yōu)良的溶解力、良好的洗滌效果和優(yōu)良熱穩(wěn)定性等特點(diǎn)，被用作干洗劑、金屬脫脂溶劑、脫硫劑及有機(jī)合成中間體等[1-2]，在精密機(jī)械、微電子、制藥、干洗、農(nóng)藥等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。自實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)以來，PCE的生產(chǎn)能力得到發(fā)展，截至2016年8月份，四氯乙烯全球年產(chǎn)量約70萬t，我國總產(chǎn)能約30.2萬t；其中約有10%～15%通過廢水進(jìn)入土壤、地表水及地下水底層和包氣帶中形成羽狀污染帶[3-4]，是地下水體中檢出率最高的有機(jī)污染物[5]，其污染范圍已擴(kuò)展到全球[6-7]。PCE易被人體和動物表皮、黏膜吸收[8]，長期吸入該物質(zhì)可產(chǎn)生致癌效應(yīng)[9]，因而被各個國家或地區(qū)普遍列入“優(yōu)先控制污染物”中首要監(jiān)控對象，對PCE污染水體和土壤的生態(tài)修復(fù)正逐步成為全球有機(jī)污染物環(huán)境研究的熱點(diǎn)。

目前，PCE污染的毒理研究主要集中于動物和人體[10-11]，對植物的毒理效應(yīng)研究尚處于起步階段，且多限于大豆、小麥等經(jīng)濟(jì)作物，但實(shí)際受PCE直接影響的植物應(yīng)多以野生地表植被為主。同時，采用植物修復(fù)法對PCE污染的水體和土壤進(jìn)行生態(tài)恢復(fù)還具有成本低、侵入性低、促進(jìn)碳隔離和環(huán)境穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，易于為大眾所接收。因此，本文選取高羊茅(Festucaelata)、黑麥草(Loliumperenne)、鴨茅(Dactylisglomerata)這3種耐旱、休眠期短、根系發(fā)達(dá)，且于自然生態(tài)環(huán)境和人工造景中均普遍栽培的冷季型草坪草為供試物種，通過模擬室內(nèi)水培環(huán)境，研究水體中PCE污染對植物種子萌發(fā)、幼苗生理影響，以及對植株體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)的毒理效應(yīng)，從而篩選出對PCE敏感性和抗逆性較強(qiáng)的植株，以期為今后深入探討地表植被對PCE毒害的植物修復(fù)機(jī)制及指示生物角色等研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

供試植物：高羊茅(貝克Pixie)、黑麥草(啟明星 Morningstar)、鴨茅(阿索斯 Athos)，購于安徽省畜牧技術(shù)推廣總站草業(yè)中心。供試溶液采用Hoagland營養(yǎng)液。

選取飽滿種子，以0.2%雙氧水浸泡15 min消毒，后蒸餾水淋洗、濾紙吸干。預(yù)處理后，將每品種50粒種子放于鋪墊2層濾紙的培養(yǎng)皿中。通過半致死試驗(yàn)確定濃度范圍，以Hoagland營養(yǎng)液為稀釋液、10%乙醇為助溶劑，一次性施入PCE，配置成濃度梯度分別為4、8、12、16和20 mg/L的溶液，以原液為對照(CK)。將培養(yǎng)皿置于25 ℃±1 ℃環(huán)境下，設(shè)置光強(qiáng)不低于40 μmol/m2·s，每日光照15 h培養(yǎng)，濾紙保持濕潤。設(shè)置6個PCE濃度梯度及3個草坪草品種處理的正交試驗(yàn)，每處理3個重復(fù)。

1.2 測試指標(biāo)及方法

1.2.1 種子萌發(fā)情況測定

種子萌發(fā)24 h后，分別于第4天、第7天統(tǒng)計(jì)其發(fā)芽勢、發(fā)芽率，連續(xù)20 h觀察記錄其發(fā)芽情況，直至對照組發(fā)芽率不再變化為止并計(jì)算發(fā)芽指數(shù)。

發(fā)芽勢(%)=4 d發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%

發(fā)芽率(%)=7 d發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%

發(fā)芽指數(shù)Gi=Σ(Gt/Dt)

Gi為發(fā)芽指數(shù)，Gt為t時間內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

1.2.2 幼苗生理指標(biāo)測定

20 d后，以電導(dǎo)儀(DDS-11D型)測得電導(dǎo)率，以相對電導(dǎo)率表征細(xì)胞膜透性。采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量[12](μmol/g·FW) ；采用酸性茚三酮法測定脯氨酸含量(μg/g·FW) 。

1.2.3 幼苗葉片抗氧化酶活性測定

分別采用南京建成生物工程研究所出售的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)活性測定試劑盒進(jìn)行測定，測試方法分別為黃嘌呤氧化酶法、比色法及可見光法。酶活性單位以U/g·min(FW)表示。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示測定結(jié)果；對同一品種草坪不同PCE濃度處理進(jìn)行組間差異顯著性分析(P<0.05，P<0.01，采用One-Way ANOVA過程) 和多重比較(采用SNK-q檢驗(yàn)法)、Pearson相關(guān)系數(shù)計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCE對草坪草種子萌發(fā)的影響

梯度濃度PCE處理下，3種草坪草種子的萌發(fā)狀況存在明顯差異(表1)。高羊茅種子萌發(fā)狀況較對照組無顯著差異，發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)與PCE處理間相關(guān)系數(shù)分別為-0.59、-0.69、-0.74，無顯著相關(guān)性。

PCE處理下鴨茅、黑麥草種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)持續(xù)受抑，但低濃度PCE(0～8 mg/L) 對鴨茅種子發(fā)芽勢有輕微促進(jìn)作用。當(dāng)PCE濃度達(dá)20 mg/L時，鴨茅、黑麥草種子發(fā)芽率分別較之對照組降低51.4%、31.5%。鴨茅種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)與PCE處理間相關(guān)系數(shù)分別是-0.81(P<0.01)、-0.96(P<0.05)、-0.86(P<0.05)；黑麥草種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)與PCE處理間相關(guān)系數(shù)分別為-0.87、-0.85、-0.73，均呈現(xiàn)顯著相關(guān)性(P<0.05)。

2.2 PCE對草坪草幼苗葉片細(xì)胞膜透性的影響

由圖1可知，3種供試草坪草幼苗葉片的電導(dǎo)率隨PCE濃度的遞增呈持續(xù)升高趨勢。在PCE最高濃度下，高羊茅、黑麥草、鴨茅葉片電導(dǎo)率分別為對照組的2.95倍、5.16倍、4.62倍，與PCE處理的相關(guān)系數(shù)分別為0.98、0.95、0.95，均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。

表1 PCE對草坪草種子萌發(fā)的影響(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤)

注：不同小寫字母表示不同PCE濃度處理組間差異顯著(P<0.05)；下同

圖1PCE對草坪草幼苗葉片細(xì)胞膜透性的影響

Figure 1 Effects of PCE on CMP in leaf of turfgrass seedling

圖2 PCE對草坪草葉片MDA含量的影響

2.3 PCE對草坪草幼苗葉片MDA含量的影響

如圖2所示，隨著PCE濃度的增加，3種草坪草幼苗葉片的MDA含量逐漸上升，當(dāng)PCE濃度為20 mg/L時，高羊茅、鴨茅、黑麥草葉片MDA比之對照組分別增長了4.44倍、3.82倍。而黑麥草葉片MDA含量受PCE濃度影響不大，其峰值僅比對照組增加了14%。高羊茅、鴨茅、黑麥草的MDA含量與PCE處理間相關(guān)系數(shù)分別為0.95、0.92、0.94，呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。

2.4 PCE對草坪草葉片幼苗脯氨酸含量的影響

PCE處理下，3種草坪草幼苗葉片脯氨酸含量具有顯著差異(圖3)。低濃度PCE(0～8 mg/L)影響下，高羊茅葉片脯氨酸含量減少，至PCE濃度為8 mg/L時降至最低，較對照組減少46.91%。而后隨著PCE濃度的繼續(xù)升高(8～20 mg/L)，脯氨酸在葉片中逐漸累積，并在較高濃度PCE(16～20 mg/L)影響下急劇增長，最高值較對照組高出1.72倍，高羊茅脯氨酸含量與PCE處理間相關(guān)系數(shù)為0.82(P<0.05)。

鴨茅、黑麥草葉片的脯氨酸含量隨著PCE濃度的增加而呈持續(xù)升高的趨勢，當(dāng)PCE濃度為20 mg/L時達(dá)到最高值，其峰值分別為對照組的4.07倍、5.61倍，鴨茅、黑麥草脯氨酸含量與PCE處理間相關(guān)系數(shù)分別為0.97(P<0.01)、0.95(P<0.01)。

圖3 PCE對草坪草葉片脯氨酸含量的影響

2.5 PCE對草坪草幼苗葉片抗氧化酶的影響

2.5.1 PCE對幼苗葉片SOD活性的影響

在梯度濃度PCE脅迫下，3種供試植株幼苗體內(nèi)SOD活性變化趨于一致(圖4)。低濃度PCE(0～8 mg/L)誘使黑麥草、鴨茅葉片SOD活性略有上升，當(dāng)PCE濃度為8 mg/L時兩種植株SOD的活性峰值較CK分別增長了56.3%、72.9%。當(dāng)PCE為20 mg/L SOD活性最低，此時鴨茅、黑麥草葉片的SOD活性分別為CK的73.6%、50.7%。PCE對鴨茅、黑麥草葉片的SOD活性抑制率分別為26.4%和49.3%。

高羊茅葉片SOD活性抗性高峰出現(xiàn)在較高濃度的PCE處理組中(12 mg/L)，此時SOD峰值較對照組增長了68.5%。之后，當(dāng)PCE繼續(xù)升高至濃度為20 mg/L，高羊茅葉片SOD活性仍較對照組高出17.6%。高羊茅、鴨茅、黑麥草葉片的SOD活性與PCE處理間相關(guān)系數(shù)分別為-0.841(P<0.05)，-0.965(P<0.01)，-0.954(P<0.01)。

圖4 PCE對3種草坪草的葉片SOD活性的影響

2.5.2 PCE對幼苗葉片CAT活性的影響

在PCE處理下，3種供試植株幼苗葉片CAT活性均先上升繼而下降；較低濃度PCE處理(高羊茅<12 mg/L，鴨茅、黑麥草<8 mg/L)對葉片的CAT活性具有誘導(dǎo)作用(圖5)。高羊茅葉片CAT活性于PCE 12 mg/L時呈現(xiàn)抗性峰。高羊茅、鴨茅、黑麥草最高CAT活性分別為對照組的1.94倍、3.15倍、4.41倍。較高濃度PCE(高羊茅>12 mg/L，鴨茅、黑麥草>8 mg/L)對葉片CAT活性具抑制效應(yīng)。高羊茅、鴨茅、黑麥草葉片的CAT活性在PCE影響下抑制率分別為15.3%、14.7%、27.9%，與PCE處理間的相關(guān)系數(shù)分別為-0.710，-0.977(P<0.01)，-0.886(P<0.01)。

2.5.3 PCE對幼苗葉片POD活性的影響

由圖6可知，低濃度PCE處理下(0～8 mg/L)，高羊茅、黑麥草和鴨茅葉片中POD活性均隨PCE濃度的遞增呈上升趨勢，說明低濃度的PCE可以促進(jìn)高羊茅幼苗的生長，高羊茅、黑麥草和鴨茅葉片POD活性的峰值分別較對照組上升了34.9%、25.3%、53.6%。隨PCE濃度繼續(xù)升高，3種草葉片POD活性則逐漸下降。高羊茅、黑麥草和鴨茅葉片POD活性與PCE處理之間的相關(guān)系數(shù)為-0.852(P<0.05)、-0.572、-0.653，高羊茅葉片POD活性與PCE濃度之間呈顯著負(fù)相關(guān)，黑麥草和鴨茅葉片POD活性與PCE濃度之間無顯著相關(guān)性。

圖5 PCE對草坪草葉片CAT活性的影響

圖6 PCE對3種草坪草POD活性的影響

3 討論

較植株成體而言，種子萌發(fā)和幼苗生長階段對外界環(huán)境不利因素更為敏感[13]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，PCE處理對高羊茅種子萌發(fā)不構(gòu)成劑量效應(yīng)；鴨茅、黑麥草種子萌發(fā)雖均呈受抑趨勢，但相同PCE濃度下(0～8 mg/L)黑麥草種子的劣變程度高于鴨茅。因此，高羊茅種子萌發(fā)對PCE脅迫具有抗性，黑麥草表現(xiàn)出敏感性。

MDA是細(xì)胞膜脂過氧化作用的重要產(chǎn)物，其含量指示膜脂過氧化程度。在較低PCE濃度下(0～12 mg/L)，PCE對高羊茅的質(zhì)膜損傷較小，黑麥草與鴨茅細(xì)胞質(zhì)膜抗性較差。高濃度PCE(16～20 mg/L)脅迫下高羊茅的細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化作用最強(qiáng)。

生物細(xì)胞對膜脂過氧化的主要應(yīng)對策略是調(diào)整滲透勢平衡，其中，脯氨酸就是一類具代表性的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)、清除過量活性氧自由基及減輕膜脂過氧化反應(yīng)等具有重要意義[14]。本試驗(yàn)中，鴨茅、黑麥草葉片的脯氨酸含量在外加PCE后立即進(jìn)行累積，高羊茅則先抑制繼而累積；高羊茅葉片脯氨酸含量最高、黑麥草最低。該結(jié)論證實(shí)，脯氨酸累積是植株對PCE毒害的應(yīng)激響應(yīng)，PCE抗性強(qiáng)的品種可積累較多的脯氨酸，因此，脯氨酸含量可作為衡量植物對PCE脅迫進(jìn)行適應(yīng)性代謝調(diào)整的生理指標(biāo)，這與張義賢[15]和Metha[16]等人的研究成果一致。

SOD、POD、CAT等酶活性之間的動態(tài)平衡是維持超氧自由基和H2O2穩(wěn)態(tài)水平的關(guān)鍵[17]。本研究中，低濃度PCE脅迫下的植株細(xì)胞能夠提高酶活性，但在更高濃度PCE或更長時間脅迫下，草坪草葉片細(xì)胞無法通過提高抗氧化酶活力來消除脅迫產(chǎn)生的氧化壓力，導(dǎo)致活性氧過量積累，對蛋白質(zhì)、脂類、核酸等生物大分子造成氧化損傷，引發(fā)活性氧過量累積[18-19]。結(jié)合電導(dǎo)率、MDA和脯氨酸的變化趨勢，本研究進(jìn)一步證實(shí)，逆境條件能夠通過促使活性氧生成增多，或抗氧化酶清除能力減弱[20]。此外，SOD作為活性氧清除的首要位點(diǎn)[21]，而POD作為敏感性較高的適應(yīng)性酶，兩者都能夠更好地反映植物體內(nèi)代謝水平及對外界環(huán)境的適應(yīng)性[22]。

在各組PCE處理中，高羊茅SOD、CAT活性的抗性峰出現(xiàn)均遲于鴨茅和黑麥草，且SOD、POD活性基本持續(xù)高于鴨茅和黑麥草，亦證實(shí)高羊茅葉片抗氧化酶系統(tǒng)的平衡閾值高于鴨茅、黑麥草，對PCE脅迫的抗逆性優(yōu)于其他兩種草坪草；鴨茅的活性氧清除系統(tǒng)最敏感。3種草坪草對PCE濃度的抗性順序從高到低依次為高羊茅、鴨茅、黑麥草。

4 結(jié)論

1) PCE處理(0～20 mg/L)對高羊茅種子萌發(fā)無顯著劑量-效應(yīng)關(guān)系，3種草坪草種子萌發(fā)對PCE脅迫的抗性從高到低依次為高羊茅、鴨茅、黑麥草。

2) PCE處理下，植株葉片脯氨酸含量大量積累，積累效率與對PCE的抗性大小成正比，其含量可以作為衡量植物對PCE脅迫抗性強(qiáng)弱的生理指標(biāo)。

3) 綜上，高羊茅對于PCE脅迫的抗逆性優(yōu)于鴨茅和黑麥草，黑麥草對PCE脅迫最敏感。因此，高羊茅可作為PCE污染地區(qū)生態(tài)修復(fù)的地面植被，而黑麥草對PCE的土壤和地下室污染具有生物指示意義。