蘇 琦，趙 娜，苗雨欣，李朝陽(yáng)，肖 童，孫雅涵，何瑪麗，田 煒，徐菁蔓△

(1.華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心，河北 唐山 063210； 2.華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，河北 唐山 063210； 3.國(guó)家科技部老年醫(yī)學(xué)國(guó)際科技合作基地，河北 唐山 063210)

心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury，MIRI)是指缺血心肌在恢復(fù)血流之后發(fā)生的更加嚴(yán)重的損傷，常出現(xiàn)梗死面積擴(kuò)大和心率失常[1]。氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)是機(jī)體受到多種有害因素刺激后，活性氧簇(ROS)產(chǎn)生過(guò)多，抗氧化能力下降對(duì)機(jī)體造成損傷。在MIRI中ROS大大增加，造成病理?yè)p傷[2]。近年來(lái),磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信號(hào)途徑已成為研究熱點(diǎn)，Akt對(duì)下游信號(hào)分子的活化起重要作用，如糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)[3]，GSK-3β磷酸化失活對(duì)于抗氧化應(yīng)激損傷尤為重要，故本實(shí)驗(yàn)以此作為研究方向。

銀杏內(nèi)酯B(ginkgolide B，GB)是銀杏葉(ginkgo biloba L)提取物。銀杏葉化學(xué)成分豐富，其主要有效成分為萜內(nèi)酯類(lèi)化合物，包括銀杏內(nèi)酯A、B、C等[4]，其中GB生理活性最強(qiáng)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，GB可以用于治療心血管疾病，具有抗炎、抗氧化等作用[6]，但在MIRI方面研究甚少。本實(shí)驗(yàn)意在探討GB能否具有發(fā)揮抗氧化應(yīng)激損傷的作用及其作用機(jī)制，以期為MIRI臨床治療提供方向。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

H9c2細(xì)胞株(來(lái)源于大鼠胚胎心臟組織)購(gòu)自美國(guó)ATCC 公司。

1.2 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)藥物銀杏內(nèi)酯B(Ginkgolide B GB)由北京百威靈科技有限公司提供(純度>99%)；H2O2(批號(hào)STBB6350)購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；兔源單克隆抗體p-Akt(Ser473)、p-GSK-3β(Ser9)、鼠源微管蛋白β-Tubulin(多克隆抗體)及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；熒光染料羅丹明123(Rhodamine 123)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所，改良Eagle 培養(yǎng)基(dulbecco'smodified eagle medium DMEM)，四甲基偶氮唑鹽比色法[3-(4、5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT] 細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒、聚氰基丙烯酸正丁酯(Butyleyanoacrylate，BCA)蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ElectrogeneratedChemiluminescence，ECL)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所，37 ℃二氧化碳CO2 培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Forma 公司；熒光酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司；生物安全柜購(gòu)自新加坡ESCO 公司；5804R 高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf 公司；JY200C 電泳儀購(gòu)自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；酶標(biāo)儀和濕轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出凍存的H9c2細(xì)胞，放入37 ℃恒溫水浴箱中溶化，在超凈工作臺(tái)中將溶好的細(xì)胞懸液移入裝有5 mlDMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、雙抗)的無(wú)菌離心管中，置于離心機(jī)離心(1000 rm，離心5 min)后棄上清，將細(xì)胞重懸于25 ml培養(yǎng)瓶中，并使其均勻分布，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(CO2濃度為5%，溫度為37 ℃，飽和濕度)中進(jìn)行培養(yǎng)；在培養(yǎng)24～48 h之后顯微鏡觀察H9c2細(xì)胞狀態(tài)，待其長(zhǎng)至大約>90%時(shí)，選擇狀態(tài)良好的H9c2細(xì)胞棄培養(yǎng)基，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline， PBS)將細(xì)胞沖洗3遍，用0.25%胰蛋白酶200 μL 消化2 min，用10 ml培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)輕輕吹打?yàn)榫鶆虻募?xì)胞懸液，分配到2個(gè)培養(yǎng)瓶中即可，每周傳代2～3次；選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，在處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且細(xì)胞數(shù)目達(dá)到80%～90%時(shí)同傳代步驟相同，將細(xì)胞消化離心后加入500 μL凍存液，使其懸浮充分混勻后移入1.5 ml凍存管中，用封口膜封口并標(biāo)記，保存于-80 ℃冰箱中(如需長(zhǎng)期保存轉(zhuǎn)入液氮罐中)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理?xiàng)l件 實(shí)驗(yàn)共分為4組。Control組：正常培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞不進(jìn)行任何藥物處理；H2O2組：650 μmol/L 處理20 min；GB+H2O2組：加入不同濃度GB(15.0、30.0、60.0 和120.0 μmol/L)處理20 min，加入H2O2650 μmol/L處理20 min；之后的研究中GB+H2O2組均采用60.0 μmol/L預(yù)處理20 min，然后用650 μmol/L處理20 min， GB組：只加入60.0 μmol/L的GB處理20 min。

1.3.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且細(xì)胞狀態(tài)良好的細(xì)胞重復(fù)培養(yǎng)步驟，待其消化離心重新懸浮后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，稀釋為1×104個(gè)/ml，96 孔板加入100 μL/孔，約1000個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)24～48 h，待其長(zhǎng)到75%左右后按照各組要求加藥處理細(xì)胞，處理后把液體全部吸出，PBS沖洗，重新加入完全培養(yǎng)基100 μL，再加入10 μL MTT，繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后，加入150 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，放置于搖床慢搖15 min后，在顯微鏡下觀察到藍(lán)色結(jié)晶物完全溶解，用酶標(biāo)儀在570 nm 處測(cè)定每孔吸光度值(optical delnsity，OD)，計(jì)算細(xì)胞的存活率(survival rate，SR)。細(xì)胞存活率%=實(shí)驗(yàn)組OD值/ 對(duì)照組OD值×100%。

1.3.4 檢測(cè)線粒體膜電位 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且細(xì)胞狀態(tài)良好的細(xì)胞重復(fù)細(xì)胞培養(yǎng)步驟，待其消化離心重新懸浮后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，稀釋為1×104個(gè)/ml，96 孔板加入100 μL/孔，約1000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h長(zhǎng)至75%左右后按照各組要求處理細(xì)胞，處理后把培養(yǎng)基全部吸出，PBS沖洗2遍，重新加入含有2 μmol/l R123的培養(yǎng)基100 μL培養(yǎng)40 min后，倒掉其中培養(yǎng)基，PBS洗2遍，再加入100 μL完全培養(yǎng)基，用酶標(biāo)儀在507～529 nm處檢測(cè)定每孔吸光度值。

1.3.5 Western blot 檢測(cè) Akt 和 GSK-3β 磷酸化蛋白表達(dá) 在2 ml小皿中細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞按照分組處理再棄培養(yǎng)基，PBS沖洗3遍，加入40 μL裂解液冰上裂解30 min, 將細(xì)胞收集于Eppendorf 管中,超聲破碎15 s,4℃ 12 000 r/min，離心15 min 后取上清液，使用二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)法進(jìn)行蛋白定量。以25μg/孔上樣，依次進(jìn)行電泳及轉(zhuǎn)膜，使用10%脫脂奶粉室溫慢搖2 h,孵育p-Akt(Ser473)、p-GSK-3β(Ser9)及β-Tublin一抗(1∶1000稀釋),4 ℃慢搖過(guò)夜(8～12 h)，Tris-HCl 緩沖鹽溶液洗3次，每次10 min；二抗(1∶1000稀釋)室溫慢搖孵育2 h，Tris-HCl 緩沖鹽溶液洗3次，每次10 min；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence，ECL)熒光顯色，用Image J 進(jìn)行灰度掃描及定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 GB對(duì)心肌氧化應(yīng)激損傷的影響

2.1.1 GB對(duì)細(xì)胞存活率的影響 表1顯示，與對(duì)照組比較， H2O2組的細(xì)胞存活率下降。不同濃度的GB預(yù)處理，MTT檢測(cè)OD值均升高，其中GB為60 μmol/L 時(shí)效果最為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明GB能減輕H2O2引起的細(xì)胞存活率下降，60 μmol/L為其最適濃度。

表1 MTT法測(cè)定GB對(duì)H9c2細(xì)胞存活率的影響

注：與control組比較:*P<0.05;與H2O2組比較:**P<0.05

2.1.2 GB對(duì)心肌細(xì)胞線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeablity transition pore，mPTP)開(kāi)放的影響 表2顯示，與對(duì)照組比較， H2O2組的熒光強(qiáng)度下降。60 μmol/L 的GB預(yù)處理，熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明GB能夠減輕H2O2引起的mPTP開(kāi)放。

表2 熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)GB對(duì)H9c2線粒體膜電位的影響

注：與control組比較：*P<0.05;與H2O2組比較：**P<0.05

2.1.3 GB對(duì)Akt磷酸化蛋白表達(dá)的影響 圖1顯示，與對(duì)照組比較， H2O2組的Akt蛋白磷酸化水平降低， GB預(yù)處理組中Akt蛋白磷酸化水平增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明GB能夠上調(diào)Akt蛋白磷酸化水平。

注：與control組比較：*P<0.05;與H2O2組比較：**P<0.05圖1 P-Akt (Ser473)蛋白表達(dá)比較

2.1.4 GB對(duì)GSK-3β磷酸化蛋白表達(dá)的影響 圖2顯示，與對(duì)照組比較， H2O2組的GSK-3β蛋白磷酸化水平降低，GB預(yù)處理組中GSK-3β蛋白磷酸化水平增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明GB能夠上調(diào)GSK-3β蛋白磷酸化水平。

注：與control組比較：*P<0.05;與H2O2組比較：**P<0.05圖2 p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達(dá)比較

3 討論

GB作為銀杏葉中活性最強(qiáng)的成分，曾被稱(chēng)為 “活化石”，具有極高的觀賞、經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值，化學(xué)成分極為豐富。有研究發(fā)現(xiàn)，GB在抗腦缺血/再灌注損傷中可發(fā)揮保護(hù)作用，明顯減輕大腦損傷[7]， 還可降低氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷[8]。近年來(lái)相關(guān)研究顯示，GB在I/R損傷方面可發(fā)揮其保護(hù)作用，降低損傷程度[9]。從本研究MTT檢測(cè)結(jié)果可以看出，GB能夠明顯減輕氧化應(yīng)激損傷，提高H9c2細(xì)胞存活率。

線粒體是機(jī)體各種生命活動(dòng)的能量來(lái)源，在維持機(jī)體正常代謝中扮演著重要角色。而mPTP是一種位于線粒體內(nèi)、外膜之間的膜通透性轉(zhuǎn)換孔，在正常情況下mPTP處于關(guān)閉狀態(tài)，阻擋離子和其他代謝物質(zhì)通過(guò)[10]。但當(dāng)各種有害因素刺激細(xì)胞時(shí)，如H2O2會(huì)導(dǎo)致線粒體鈣超載和氧化應(yīng)激程度增加，線粒體膜及電子傳遞鏈發(fā)生氧化損傷， ATP 產(chǎn)生大大減少，線粒體穩(wěn)定狀態(tài)被破壞，從而產(chǎn)生大量ROS[11]，使細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激性損傷，沒(méi)有足夠的ATP就會(huì)使mPTP處于開(kāi)放狀態(tài)[12]，大量本被阻擋在線粒體外的分子、離子涌入線粒體內(nèi)，導(dǎo)致?lián)p傷引發(fā)細(xì)胞凋亡。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，若能抑制mPTP開(kāi)放，就有可能降低細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[13]。本研究熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果表明，銀杏內(nèi)酯B能夠抑制mPTP 開(kāi)放，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激損傷作用，這表明銀杏內(nèi)酯B也可通過(guò)線粒體機(jī)制發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

PI3K/AKT信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)非常重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路之一，可以在機(jī)體多種生命活動(dòng)過(guò)程中影響下游效應(yīng)分子(一氧化氮合酶、Bcl-2 家族、胱天蛋白酶9(caspase-9)等)的活化狀態(tài)，從而發(fā)揮抗凋亡、減輕細(xì)胞損傷的作用。由于AKT磷酸化之后可產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，因此若采用阻斷此通路中關(guān)鍵環(huán)節(jié)的方法，就可能有效防治I/R損傷及細(xì)胞凋亡等[14]。目前已有研究顯示，通過(guò)藥物靶向治療Akt通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，可明顯減輕心肌損傷和細(xì)胞凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示，GB能夠使Akt磷酸化蛋白表達(dá)明顯增加，提示GB可能是通過(guò)PI3K/Akt通路發(fā)揮抗心肌細(xì)胞氧化損傷作用。

GSK-3β是GSK-3亞型之一，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，具有重要的細(xì)胞調(diào)節(jié)功能，廣泛分布于哺乳動(dòng)物真核細(xì)胞中[16]。在正常狀態(tài)下GSK-3β處于激活狀態(tài)，當(dāng)其被磷酸化后則失活，若能抑制GSK-3β活性就可提高心肌細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力。近年來(lái)各項(xiàng)研究表明，GSK-3β與I/R損傷等心血管疾病密切相關(guān)[17]，同時(shí)也是參與肝糖代謝的關(guān)鍵酶，廣泛參與體內(nèi)多種功能活動(dòng)的調(diào)節(jié)。GSK-3β也與細(xì)胞凋亡、損傷等緊密關(guān)聯(lián)，主要是通過(guò)磷酸化多種底物蛋白來(lái)調(diào)節(jié)糖原的合成代謝，參與細(xì)胞的分化、增殖等[18]。有研究認(rèn)為，GSK-3β是心肌保護(hù)通路的一個(gè)重要交點(diǎn)，GSK-3β磷酸化在上游信號(hào)AKT作用下增強(qiáng)，從而減輕MIRI。本研究結(jié)果顯示，GB能夠上調(diào)GSK-3β磷酸化蛋白的表達(dá)，提示GB可能是通過(guò)此途徑發(fā)揮心肌保護(hù)作用的。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GB預(yù)處理可以使H9c2細(xì)胞存活率升高，并提示 GB可能是通過(guò)PI3K/Akt 途徑抑制GSK-3β活性, 減少mPTP 開(kāi)放，從而減輕氧化應(yīng)激引起的心肌細(xì)胞損傷。