鄧 可，封 慧，王志鵬，王長松

(1. 句容市中醫(yī)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212400； 2. 東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院，南京 210009)

血小板在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、腦梗塞等過程中充當(dāng)著重要角色，在這些病理過程中，血小板的黏附、釋放等功能發(fā)揮重要功能。血小板膜上有多種受體，作為傳遞外界信號進(jìn)入血小板的主要工具，決定了血小板對于不同激動劑和黏附蛋白的反應(yīng)性。表面受體和內(nèi)部顆粒在很大程度上決定了血小板的細(xì)胞特性[1]：與其他有核細(xì)胞不同，血小板缺少細(xì)胞核，因此無法依靠基因調(diào)控和蛋白合成應(yīng)對于外界環(huán)境的改變，盡管有部分證據(jù)顯示從巨噬細(xì)胞攜帶殘留的mRNA具有合成蛋白的能力，但是大量的研究表明血小板主要依賴與多種受體傳導(dǎo)信號來應(yīng)對不同的生理?xiàng)l件和病理改變[2]。薤白有行氣導(dǎo)滯、通陽散瘀的功效，是治療胸痹、真心痛的要藥?！秱摗芳?011年版《中藥、天然藥物治療冠心病心絞痛臨床研究指導(dǎo)原則》中相關(guān)方劑“栝樓薤白白酒湯”“栝樓薤白半夏湯”“枳實(shí)薤白桂枝湯”是臨床常用治療胸痹、真心痛的名方[3]。研究表明，薤白中皂苷類化合物通過抗血小板聚集、抗氧化、降血脂參與冠狀動脈粥樣硬化的整個(gè)過程[4]，但其微觀機(jī)制并未被解釋。薤白中皂苷類化合物通過何種信號通路影響血小板的黏附、釋放等功能尚待研究。為此本課題組研究了薤白皂苷化合物離體環(huán)境下對血小板活化因子誘導(dǎo)的血小板聚集的干預(yù)及對表面糖蛋白水平的影響，現(xiàn)描述如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

篩選2016年4月至2017年7月我科門診收集的冠心病痰阻心脈證或陰寒凝滯證的患者共8例，47～75歲，同時(shí)符合冠心病和胸痹心痛中醫(yī)證型診斷標(biāo)準(zhǔn)，簽署知情同意書。冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)：患者均經(jīng)冠狀動脈造影證實(shí)，主要冠狀動脈(左前降支LAD、左回旋支LCX、右冠狀動脈RCA)中至少有一支內(nèi)徑狹窄>50%。涉及證型診斷參照2011年版《中藥、天然藥物治療冠心病心絞痛臨床研究指導(dǎo)原則》[3]中的胸痹心痛辨證分型：寒痰阻滯證需滿足痰阻心脈證或陰寒凝滯證任意一個(gè)或兩者均滿足，由兩名中醫(yī)主治醫(yī)師盲法確診，診斷一致者即納入。研究對象均排除急性感染、自身免疫性疾病、惡性腫瘤、嚴(yán)重肝腎功能不全、I型糖尿病、甲狀腺疾病、精神疾病及使用肝素、氯吡格雷、華法令等抗血栓藥物者(阿司匹林除外)。所有入選者均自愿簽署知情同意書。

1.2 藥物及制備

薤白皂苷：將新鮮薤白鱗莖(南京鶴齡藥事服務(wù)有限公司特別提供，產(chǎn)地：河南省平頂山市)搗碎，先用乙醇從中提取出薤白總皂苷，然后運(yùn)用多種色譜學(xué)方法分離出已知化學(xué)結(jié)構(gòu)的6種薤白皂苷(saponins from allium macrostemon bunge bulbs，SAMBB)混合物[6-7]。替卡格雷(astraZeneca AB，批號J20130020)500 mg/片。

1.3 主要試劑與儀器

ADP和人凝血酶，Hoffmann-La Roche Ltd；二甲基亞砜(DMSO)、MRS2179、MRS2395、Sigma Chemical Co.；CD61FITC、CD62pPE、Goat anti-Human IgG，美國Santa公司。AA和PAF溶解于PBS，于100 mmol/L Na2CO3和Tris-NaCl緩沖液分別加入0.25%牛血清白蛋白。高速離心機(jī)(型號GL10MA)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；微孔板振蕩器(型號MPS40)，上海達(dá)姆實(shí)業(yè)有限公司；流式細(xì)胞儀，美國BD公司；生物發(fā)光凝集測定儀，ChronoLog Corp，Havertown。

1.4 血小板制備

取患者靜脈血10 ml，置于3.8%枸櫞酸鈉的CTAD真空管(BD公司)中，分別于180×g和1000×g離心10 min得富血小板血漿(PRP)，PRP以1000×g離心10 min，然后將細(xì)胞重懸于PBS(含有1.0%牛血清白蛋白和1 mmol/L CaCl2)中洗滌，通過臺盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞存活率高于95%，將細(xì)胞濃度調(diào)至108/mL。

1.5 血小板聚集

體外血小板聚集：PRP中血小板聚集率參照文獻(xiàn)[4]Born法所述進(jìn)行測量。用生物發(fā)光凝集測定儀監(jiān)測最大聚集率(誘導(dǎo)血小板聚集濃度ADP：3 μmol/L；AA：0.35 mmol/L；PAF：7.2 nmol/L)。計(jì)算藥物抑制血小板聚集率。血小板聚集率=(A-B)÷A×100%。公式中A是添加對照物(生理鹽水)時(shí)濁度的最大變化，B是加入藥物(薤白皂苷、替卡格雷)時(shí)濁度的最大變化。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)

血樣分為對照組(未活化)、ADP誘導(dǎo)血小板凝集組、薤白皂苷低濃度組(0.3 mg/ml)、薤白皂苷中濃度組(0.6 mg/ml)、薤白皂苷髙濃度組(1.2 mg/ml)6組。室溫溫育10 min后，除靜息組外其余各組均分別加入25uM ADP刺激5 min。取上述各組樣品各5 μl，加入5 μl CD41PE/CD62pPE、5 μl CD61FITC，靜息組加入5 μl抗人IgG-PE作為陰性對照，室溫避光解育30 min，加PBS至0.5 ml重懸，混勻后上機(jī)檢測。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血小板聚集率

表1 薤白皂苷對ADP誘導(dǎo)冠心病寒痰阻滯證血小板聚集率的影響

注：與SAMBB高濃度比圈外:aP<0.05；與SAMBB高濃度比較：bP<0.01

表1顯示，本步驟觀察薤白皂苷(SAMBB)離體環(huán)境給藥對ADP誘導(dǎo)的冠心病寒痰阻滯證血小板聚集的抑制作用，冠心病寒痰阻滯組中，薤白皂苷中濃度、高濃度與生理鹽水對照組比較，可顯著抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，并呈濃度依賴性(t=16.02，P<0.01；t=40.99，P<0.01)；陽性藥替卡格雷抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率顯著高于薤白皂苷高濃度組(t=8.20，P=0.005)。

2.2 CD62p的表達(dá)

表2顯示，本實(shí)驗(yàn)使用25 μMol ADP作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)富血小板血漿使血小板活化，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度薤白皂苷給藥前后血小板后膜蛋白CD62p表達(dá)率的變化。ADP誘導(dǎo)活化后，血小板膜蛋白CD62p表達(dá)率顯著升高，4 μmol/L的薤白皂苷顯著降低CD62p的表達(dá)率(t=-1.64，P<0.01)，表明薤白皂苷濃度依賴性地抑制血小板的活化。

表2 薤白皂苷對ADP活化的血小板CD62p、GPIIb/IIIa表達(dá)及聯(lián)合ADP括抗劑對血小板活化的影響

注：與SAMBB高濃度比較：aP<0.05；與SAMBB高濃度比較：bP<0.01

2.3 GPIIb/IIIa的表達(dá)

表2顯示，本實(shí)驗(yàn)使用25 μMol ADP作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)富血小板血漿使血小板活化，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度薤白皂苷給藥前后血小板后膜蛋白GPIIb/IIIa表達(dá)率的變化。ADP誘導(dǎo)活化后，血小板膜蛋白GPIIb/IIIa表達(dá)率顯著升高，4 μmol/L的薤白皂苷下GPIIb/IIIa的表達(dá)率與0.16 μmol/L的薤白皂苷下、未活化及活化后血小板膜蛋白GPIIb/IIIa表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.4 通過ADP受體對血小板活化的影響

血小板膜上有2種ADP受體，分別是P2Y1和P2Y12。為分別研究薤白皂苷對這2種受體的作用，本研究用到P2Y1受體括抗劑MRS2179和P2Y12受體括抗劑MRS2395。

研究薤白皂苷對P2Y1受體作用，需聯(lián)合括抗劑MRS2395(20 uMol)阻斷P2Y12受體，低、中、高濃度的薤白皂苷聯(lián)合括抗劑MRS2395下ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率均顯著高于ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率(t=28.27，P<0.01；t=40.97，P<0.01；t=50.70，P<0.01)，并呈濃度依賴性。

研究薤白皂苷對P2Y12受體作用，需聯(lián)合括抗劑MRS2179(20 uMol)阻斷P2Y1受體，低、中、高的薤白皂苷聯(lián)合括抗劑MRS2179下ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率顯著高于ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率(t=41.70，P<0.01；t=43.67，P<0.01；t=50.96，P<0.01)，并呈濃度依賴性。

3 討論

《傷寒論》中記載的“栝樓薤白白酒湯”“栝樓薤白半夏湯”“枳實(shí)薤白桂枝湯”是臨床常用的治療胸痹、真心痛的名方。薤白是治療冠心病的要藥，研究發(fā)現(xiàn)薤白中皂苷類化合物通過抗血小板聚集、抗氧化、降血脂參與冠狀動脈粥樣硬化的整個(gè)過程?！吨嗅t(yī)內(nèi)科學(xué)》七版及2011年國家頒布的《中藥、天然藥物治療冠心病心絞痛臨床研究指導(dǎo)原則》[3]均指出，冠心病痰阻心脈證或陰寒凝滯證的治療中需要用到薤白，故認(rèn)為痰阻心脈證或陰寒凝滯證患者接受薤白治療時(shí)的敏感度更高，符合中醫(yī)“有是證則用是藥”的范疇。本研究中將痰阻心脈證和陰寒凝滯證合稱為寒痰阻滯證，即包含痰阻心脈證或陰寒凝滯證兩證中的1種或兩證均具備。本研究從微觀角度分析冠心病痰阻心脈證或陰寒凝滯證患者對于薤白治療敏感的機(jī)制，并從血小板表明膜蛋白表達(dá)情況初步分析薤白皂苷作用的受體和信號通路。

首先，本研究探討冠心病寒痰阻滯證患者的血小板對于薤白皂苷的敏感性是否存在，觀察薤白皂苷離體環(huán)境給藥對ADP誘導(dǎo)的冠心病寒痰阻滯證血小板聚集的抑制作用。本研究結(jié)果顯示，薤白皂苷中濃度、高濃度可顯著抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，并呈濃度依賴性。

血小板表面受體主要包括酪氨酸激酶受體、整合素家族、七層跨膜受體、C型凝集素受體家族、Leucine-Rich Repeat家族[6]。P-選擇素(CD62p)屬于C型凝集素受體家族，是最早參與和體現(xiàn)血小板活化的重要標(biāo)志物之一。在靜息狀態(tài)下，血小板表面表達(dá)的CD62p較少，多數(shù)的CD62p存在于血小板內(nèi)α顆粒膜上；當(dāng)血小板活化形變后，α顆粒膜與血小板膜融合，CD62p即表達(dá)于血小板膜上，所以CD62p是最具代表性的血小板活化標(biāo)志物，是血小板功能檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”[7]。本研究結(jié)果顯示，薤白皂苷顯著抑制ADP誘導(dǎo)后的血小板活化。

GPIIb/IIIa是纖維蛋白原受體，在靜息狀態(tài)下纖維蛋白原受體位點(diǎn)未暴露，血液中纖維蛋白原不能與其結(jié)合，血小板活化后構(gòu)型改變，GPIIb/IIIa暴露出纖原識別位點(diǎn)并與纖原結(jié)合，通過這種方式血小板互相連接、聚集[8]。GPIIb/IIIa是血小板聚集的最終共同通路。阿昔單抗、替羅非班就是通過拮抗GPIIb/IIIa受體位點(diǎn)來抑制血小板聚集[9]。本研究結(jié)果顯示，薤白皂苷可通過GPIIb/IIIa信號通路對血小板活化進(jìn)行影響，所以薤白皂苷可能通過此信號通路影響血小板聚集。

血小板膜上有2種ADP受體，分別是P2Y1和P2Y12。P2Y1偶聯(lián)Gq蛋白，激活磷脂酶C，通過増加血小板胞漿內(nèi)鈣離子濃度，誘導(dǎo)血小板聚集；P2Y12偶聯(lián)Gi蛋白，抑制腺巧酸環(huán)化酶活性，引起血小板聚集。2個(gè)受體需一起才能誘導(dǎo)血小板活化，抑制其中一個(gè)受體，即可影響血小板聚集[10-11]。為分別研究薤白皂苷對這2種受體的作用，本研究用到了P2Y1受體括抗劑MRS2179和P2Y12受體括抗劑MRS2395，發(fā)現(xiàn)薤白皂苷分別作用于這2種受體進(jìn)而抑制血小板聚集。

綜上所述，薤白皂苷對于痰阻心脈證和陰寒凝滯證者ADP誘導(dǎo)的血小板聚集有更好的抑制作用，其可能作用于P2Y1和P2Y12，通過降低胞漿內(nèi)巧離子濃度和升高CAMP含量，抑制血小板聚集的效果。