徐艷　王玲　董洋　郭冬梅　李延輝

【摘要】 目的：探討B(tài)ouin氏液二次固定時間對Masson三色染色效果的影響，進一步尋找Bouin氏液二次固定的最佳條件。方法：取5例肝纖維化模型家兔肝臟組織（10%中性福爾馬林固定）的蠟塊，切片、脫蠟后，用Bouin氏液二次固定，固定時間分別為0 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、過夜。進行Masson三色染色并用光鏡和統(tǒng)計軟件分析比較染色結(jié)果。結(jié)果：未經(jīng)二次固定的切片與所有經(jīng)過二次固定的切片染色評分比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;二次固定過夜的染色效果最好，其與二次固定4 h染色評分比較，差異無統(tǒng)計意義（P>0.05）。結(jié)論：Bouin氏液二次固定的肝纖維化切片的Masson三色染色效果優(yōu)于僅經(jīng)福爾馬林固定的切片;二次固定4 h或過夜切片的染色效果最佳。

【關(guān)鍵詞】 Bouin氏液; 10%中性福爾馬林; Masson三色染色; 肝纖維化

【Abstract】 Objective：To evaluate the results of Massons tri-colour staining at different times of re-fixation the paraffin fixation sections in Bouins solution，searching for the best condition for re-fixation in Bouins solution.Method：The wax block of 5 liver fibrosis model rabbit liver tissue（10% neutral Formalin fixation）was taken.Bouins solution was used to re-fixation the paraffin fixed sections after slicing and dewaxing.The re-fixation time were 0 min，15 min，30 min，1 h，2 h，4 h，all night long.Proceeding Massons tri-color staining.The staining results with light microscopy and statistical software were compared.Result：There were statistically significant differences in taining scores between re-fixation sections and the Paraffin fixed sections（P<0.05）.Among all the groups，the group whose re-fixation time of all night long had the best staining effect，and it had no statistically significant difference with the group whose re-fixation time of 4 h（P>0.05）.Conclusion：Massons tri-colour staining of liver fibrosis sections fixed with Bouins solution twice was better than that of fixation with Formalin only.

【Key words】 Bouins solution; 10% moderate Formalin; Massons tri-colour staining; Liver fibrosis

First-authors address：Dalian Jinzhou First Peoples Hospital，Dalian 116100，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.12.006

Masson三色染色（以下簡稱Masson染色）是一種經(jīng)典的特殊染色方法，可以顯示細胞核、細胞質(zhì)和細胞外膠原三種組織結(jié)構(gòu)[1]，尤其易于觀察膠原纖維的空間結(jié)構(gòu)[2]，可以彌補在HE染色中被染成淡粉色而與肌纖維等成分難以區(qū)分的不足，但因該染色操作繁瑣、對組織固定要求高等問題一直未能在常規(guī)病理診斷中得到普及應(yīng)用。研究顯示Bouin氏液固定組織Masson染色效果優(yōu)于病理科最常用的組織固定劑——10%中性福爾馬林[3-6]。有研究報道，經(jīng)甲醛固定的組織如果要獲得滿意的Masson染色效果，必須再經(jīng)過第二次固定[7]。本實驗試探討福爾馬林固定的石蠟組織使用Bouin氏液二次固定的時間對Masson染色效果的影響，進一步尋找Bouin氏液二次固定的最佳條件。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 收集四氯化碳誘導肝纖維化模型家兔肝組織蠟塊，由大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院郭冬梅課題組提供。所有標本在離體后均經(jīng)10%中性福爾馬林固定;所有蠟塊切片均已進行Batts-Ludwig肝纖維化分期[6]，從0～4期（F0～F4期）肝纖維化組織蠟塊中各隨機挑選1例（共計5例）納入本實驗。

1.2 主要試劑與儀器 Bouin氏液（1.22%苦味酸飽和液、甲醛、冰醋酸按15︰5︰1的比例混合），購自北京華越洋生物科技有限公司;Masson染色試劑套裝，包括Weigert鐵蘇木素A液（主要含蘇木素）、Weigert鐵蘇木素B液（主要含三氯化鐵水溶液）、麗春紅酸性品紅染液、磷鉬酸溶液、苯胺藍染液，購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司;甲醛溶液、無水酒精、二甲苯，均為分析純，均購自天津市大茂化學試劑廠;冰醋酸，分析純，購自西隴科學股份有限公司。所需儀器主要有Thermo HM340E切片機、亞光生物組織攤拷片機、恒宇電熱恒溫箱、OLYMPUS BX43光學顯微鏡。

1.3 切片與分組 本實驗依二次固定時間的不同分為A、B、C、D、E、F、G組，分別進行染色，其中A組不進行二次固定，B～G組均采用Bouin氏液進行二次固定，固定溫度37 ℃，固定時間：B組15 min、C組30 min、D組1 h、E組2 h、F組4 h、G組過夜。每例蠟塊連續(xù)切7張3.5 μm厚白片且均按照A～F順序編號（共計35張），60 ℃烤片1 h備用。

1.4 方法與步驟 （1）脫蠟：二甲苯60 ℃ 0.5 h兩次，無水酒精10 min兩次，95%酒精10 min兩次，75%酒精10 min兩次后至水;（2）二次固定（具體見“分組”，A組跳過此步），流水沖洗至黃色褪盡（約10 min）;（3）媒染：Weigert鐵蘇木素A、B混合液滴染10 min，自來水稍洗;（4）分化返藍：1%鹽酸酒精數(shù)秒，自來水沖洗10 min，蒸餾水稍洗;（5）麗春紅酸性品紅溶液滴染10 min，蒸餾水洗稍洗;（6）磷鉬酸溶液滴染3 min，傾去;（7）苯胺藍溶液滴染3 min，傾去;（8）1%冰醋酸溶液涮洗至無藍色脫出;（9）脫水、透明：95%酒精稍洗兩次，無水酒精10 min兩次，二甲苯10 min兩次;（10）中性樹膠封固。本實驗共分7次完成（每次進行一組），每組實驗除二次固定時間不同外，其余實驗條件及步驟均嚴格統(tǒng)一標準化進行。

1.5 染色評分 光鏡下每張切片隨機選取5個低倍視野，分別對A～G組35張切片的Masson染色情況進行評估。本實驗Masson染色質(zhì)量評估參考李金龍等[8]的方法從膠原纖維、細胞質(zhì)、核質(zhì)分明程度以及細胞核分辨率四個方面分別進行評估，具體評估標準：膠原纖維（不著色0分、著色不均勻或有暈1分、著色均勻且中等強度2分、著色均勻且高強度3分）、細胞質(zhì)（不著色0分、著色不均勻1分、著色均勻且中等強度2分、著色均勻且高強度3分）、核質(zhì)分明（無0分、弱1分、中等2分、強3分）、核分辨率（無0分、低1分、中等2分、高3分）。參照Metgud等[9]的方法，本次評分總得分范圍為0～12分（0～4分表示染色效果不滿意、5～7分表示染色可以滿足診斷但效果一般、8～12分表示染色可以滿足診斷且效果較好）。采用單盲評分，由本科一名資深的主任醫(yī)師完成。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，多組間比較采用方差分析。并用Graph Pad Prism 5.0進行作圖分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

肉眼觀察G、F、E、D、C、B、A組中的肝組織切片，顏色由紫紅色到紫黑色逐漸加深。光鏡下，G組切片中膠原纖維染成藍色，肝細胞漿、平滑肌肌纖維等胞質(zhì)以及紅細胞染成不同程度的紅色，胞核染成黑褐色，核質(zhì)分明，顏色鮮麗，對比度清晰，F(xiàn)組的情況與之相仿;E、D、C、B、A組切片光鏡下依次顯示背景染色逐漸加深;A組中肝細胞漿呈深紫紅色，與肝細胞核辨別困難，在其背景上的膠原纖維不易識別;0期纖維化肝組織的膠原纖維在各組中著色普遍較淡，A～E組內(nèi)新形成的細絲狀膠原纖維邊緣均可見暈染;F和G組相對染色效果較好，膠原纖維、細胞質(zhì)、細胞核以及核漿對比度均顯色較清晰。

本實驗各組5例不同程度的纖維化肝組織Masson染色評分顯示，D、E、G、F四組的染色評分均值都在7分以上，可以滿足診斷需要;而A、B、C三組的染色評分中均有低于5分者，屬染色效果不滿意。經(jīng)方差分析結(jié)果顯示，組間差異有統(tǒng)計學意義（F=31.476，P=0.000）;進一步各組兩兩比較顯示，A組與其余B～G組的染色評分比較差異均有統(tǒng)計學意義（P=0.000）;G組分別與B、C、D、E組評分比較差異均有統(tǒng)計學意義（P=0.000、0.000、0.000、0.005）;F組分別與B、C、D組評分比較差異均有統(tǒng)計學意義（P=0.000、0.000、0.017）;E組分別與B、C組評分比較差異均有統(tǒng)計學意義（P=0.000）;D組分別與B、C組評分比較差異也均有統(tǒng)計學意義（P=0.004、0.012）;B組與C組、D組與E組、E組與F組、F組與G組的評分比較差異均無統(tǒng)計學意義（P=0.688、0.181、0.284、0.083）。見表1。提示二次固定實驗組中，G組的染色效果最好，其與F組的染色效果相當;E組和D組的染色效果居中，且兩者的染色效果相當;B組和C組的染色效果最弱，且兩者染色效果相當。進一步采用GraphPad Prism 5.0對各組中不同程度纖維化肝組織染色評分的均值進行分析，得出不同程度纖維化肝組織在不同二次固定時間下Masson染色評分均值分布情況。0～4期的肝纖維化組織在D、E、F、G組的染色效果明顯優(yōu)于A、B、C組，其中G組的染色效果最好，F(xiàn)組與其評分比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見圖1。

3 討論

3.1 Bouin氏液在Masson染色中的優(yōu)勢 本實驗結(jié)果顯示，纖維化肝組織Masson染色效果與二次固定的條件及時間差異有關(guān)（P=0.000），所有經(jīng)Bouin氏液二次固定后的纖維化肝組織Masson染色效果均明顯優(yōu)于僅經(jīng)甲醛固定后的組織（P=0.000），此結(jié)果與陳余朋等[10]的研究結(jié)果相似。本實驗所用的Masson染色法是聯(lián)合使用媒染劑（鐵、鉬）和分子量大小不同的染料（苯胺藍、麗春紅、酸性品紅等）選擇性的作用于膠原纖維、肌纖維、細胞質(zhì)、紅細胞以及細胞核，使其顯示不同程度的藍、紅、黑褐等三種色系。趙熒等[11]認為固定后的組織因其蛋白質(zhì)暴露于固定劑，結(jié)構(gòu)鏈與之發(fā)生作用形成蛋白質(zhì)“網(wǎng)絡(luò)”，這些“網(wǎng)絡(luò)”因其孔隙大小和數(shù)量的不同而具有不同特征;染色時分子量不同的染料對組織結(jié)構(gòu)的選擇性作用以及組織內(nèi)部因固定所形成的結(jié)構(gòu)（即“網(wǎng)絡(luò)”）變化便決定了Masson染色的成敗;小的染料分子可浸透至?。ㄈ缂t細胞）、中（如肌纖維、細胞質(zhì)）、大（如膠原纖維）三種“網(wǎng)絡(luò)”內(nèi);中等大的染料分子可置換出位于中、大“網(wǎng)絡(luò)”內(nèi)的小染料分子而著色;大分子染料則可置換出位于大“網(wǎng)絡(luò)”中的中、小染料分子進行著色。因此，使用有利于形成大、中、小“網(wǎng)絡(luò)”的組織固定劑是做好Masson染色的關(guān)鍵。Bouin氏液是一種包括苦味酸、甲醛和冰醋酸的混合固定液，其中冰醋酸能使組織膠原纖維膨脹[12]，其與苦味酸配伍能抑制苦味酸對膠原纖維的收縮[13]，這種固定液穿透力均勻且迅速、組織收縮不明顯[14-15];而福爾馬林固定液成分則相對單一，無法像Bouin氏液一樣做到對組織內(nèi)在結(jié)構(gòu)膨脹與收縮不同層次的細微調(diào)整。

3.2 最佳的二次固定時間 本實驗中，光鏡下纖維化肝組織Masson染色效果的好壞主要表現(xiàn)在新形成的細絲狀膠原纖維邊緣的暈染以及膠原纖維與背景組織著色的對比度上。研究表明，固定時間不足、完全滲入細胞內(nèi)的固定液不足，導致細胞成分固定不均勻[16]，影響染色效果。本實驗結(jié)果顯示在所有二次固定的纖維化肝組織中，過夜的染色效果最好，4 h次之，2、1 h居中，30、15min最差;其中，二次固定過夜與4 h的染色效果均能達到較好的程度，日常工作中在保證染色質(zhì)量不影響診斷的條件下，F(xiàn)組相比G組制片所需時間更短，效率更高，更符合工作要求。

3.3 Masson染色的其他影響因素 依本次實驗所得經(jīng)驗，除固定液外，Masson染色過程中還需注意以下問題：（1）切片脫蠟徹底。保持脫蠟劑的濃度，做到及時更換，可避免因脫蠟不足造成的組織與染料無法充分結(jié)合而有模糊不清的表現(xiàn)。本實驗采用60 ℃二甲苯脫蠟，可快速徹底地將石蠟脫干凈。（2）褪黃徹底：切片在經(jīng)Bouin氏液固定后，務(wù)必將固定液洗凈后再進行后續(xù)染色。（3）Weigert鐵蘇木素A、B液即用即配：因為鐵與染色劑的色素根化合后會形成不溶性沉淀而不能在配置后長期放置。（4）光鏡下調(diào)整磷鉬酸的分化程度：當紅染的膠原纖維變淡，區(qū)別于肌纖維時即可終止分化——此步驟很關(guān)鍵[17]，因為磷鉬酸既是分化劑也是膠原纖維的特異性媒染劑，在分化時它選擇性作用于膠原纖維，使其釋放已結(jié)合的中分子染料（呈淡紅色），而后與大分子染色劑苯胺藍相結(jié)合形成復(fù)合物，牢固地附著于膠原纖維上（顯藍色）。（5）冰醋酸溶液與95%酒精均有一定的脫色性，浸洗時不可時間過長，否則會引起褪色而影響染色效果[18]。

本實驗中，二次固定1、2 h的纖維化肝組織的染色效果雖然也可以滿足診斷需要，但是與4 h和過夜的染色效果相比還有一定差距。筆者認為倘若適當提高二次固定的溫度，固定液滲透速度加快，或許會改善這兩組的染色效果，這一假設(shè)尚有待進一步實驗證實。

綜上所述，Bouin氏液二次固定的肝組織切片進行Masson染色確定可以達到滿意效果，以過夜和4 h的染色效果為最佳。滿意的Masson染色既能顯示波浪狀分布的成熟纖維束，也能清晰顯示較難識別細絲狀的新生膠原纖維，現(xiàn)多用于評估肝穿、腎穿組織炎癥時的修復(fù)情況和纖維化程度[19-20]，極具應(yīng)用價值。經(jīng)濟又有效的Bouin氏液二次固定無疑能為只有甲醛固定標本的基層醫(yī)院病理科開展Masson染色解決標本固定的難題，值得臨床推廣。

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（收稿日期：2018-11-07） （本文編輯：程旭然）