周洋，金志軍，王丹，吳玉仙，王成才

宮頸癌是惡性程度極高的婦科惡性腫瘤之一， 其發(fā)病率和死亡率在惡性婦科腫瘤中僅次于乳腺癌[1]。宮頸癌的惡性生物學(xué)特征主要是癌細(xì)胞的過(guò)度增殖和侵襲，但至今仍未明確其具體的調(diào)控機(jī)制[2]。磷脂酰肌醇 3 激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（Akt）信號(hào)通路參與許多腫瘤的重要生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞的增殖凋亡、轉(zhuǎn)錄翻譯、能量代謝和細(xì)胞周期調(diào)控等[3]。研究表明在人乳頭瘤病毒（HPV）陽(yáng)性的宮頸鱗狀細(xì)胞癌中，PI3K/Akt信號(hào)通路經(jīng)常被激活，且與腫瘤細(xì)胞的增殖和存活有關(guān)[4-5]。

色素上皮衍生因子（PEDF）是絲氨酸蛋白酶超家族成員之一的多功能旁分泌糖蛋白，其廣泛分布于人體大多數(shù)組織和器官[6]。最近有研究表明，PEDF具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，主要是通過(guò)抑制腫瘤血管新生從而造成腫瘤細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的[7]。據(jù)報(bào)道，在小鼠宮頸癌組織中PEDF表達(dá)量下降，且通過(guò)外源性注射PEDF的方式可使宮頸癌腫塊縮小68%，腫瘤組織微血管密度顯著下降[8]。但PEDF的抗腫瘤作用是否與調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)目前尚不明確。c-Met即肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（hepatocyte growth factor receptor,HGFR）是原癌基因的編碼產(chǎn)物。c-Met在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，除了有刺激細(xì)胞增殖、血管新生及阻止細(xì)胞凋亡等作用外，還可促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，故被認(rèn)為是腫瘤侵襲相關(guān)蛋白[9-10]。而PEDF對(duì)腫瘤組織中c-Met蛋白表達(dá)的影響目前也有待確認(rèn)。因此，本研究通過(guò)建立PEDF蛋白預(yù)處理的宮頸癌HeLa細(xì)胞模型，探究PEDF對(duì)腫瘤細(xì)胞活性和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的作用是否與PI3K/Akt通路的調(diào)節(jié)有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 病例資料 本研究標(biāo)本來(lái)自于上海長(zhǎng)征醫(yī)院病理科收集的2016年10月—2018年10月手術(shù)切除后經(jīng)病理學(xué)診斷確診的40例宮頸癌組織及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本，患者年齡 28～75歲，平均年齡（50.5±10.1）歲，其中≤50歲 18例，＞50歲22例；腫瘤直徑大小≤4 cm者24例，＞4 cm者16例；腫瘤浸潤(rùn)≤1/2肌層者10例，＞1/2肌層者30例；病理分級(jí)Ⅰ級(jí)6例，Ⅱ級(jí)11例，Ⅲ級(jí)23例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者25例，陽(yáng)性者15例。

1.2 主要材料和儀器 人宮頸癌HeLa細(xì)胞株購(gòu)自上海中科院細(xì)胞典藏館；人正常宮頸上皮HCerEpiC細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ScienCell公司；胎牛血清（FBS，#10100154）和 DMEM 高糖培養(yǎng)基（#10566024）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；免疫組織化學(xué)ABC試劑盒（#AK-5200）和 DAB 顯色劑（#SK-4100）購(gòu)自美國(guó)Vector公司；CCK-8細(xì)胞活性測(cè)定試劑盒（#CK04）購(gòu)自日本Dojindo公司；重組人PEDF蛋白（#ab86705）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；PI3K 抑制劑 LY294002（#1130）、Akt抑制劑 GSK 690693（#4144）、PI3K 激活劑 740 Y-P（#1983）和 Akt激活劑IGF-1（#291-G1）購(gòu)自美國(guó)R&D公司；PEDF多克隆抗體（#ab180711）、PI3K多克隆抗體（#ab154598）、p-Akt多克隆抗體（#ab38449）、Akt單克隆抗體（#ab179463）、c-Met單克隆抗體（#ab51067）和 β-actin單克隆抗體（#ab8226）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。細(xì)胞兩氣培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；倒置熒光顯微鏡和PM-CB20顯微照相系統(tǒng)購(gòu)自日本Olympus公司；Synegy2多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek公司；Odyssey凝膠掃描儀購(gòu)自美國(guó)Li-cor公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及預(yù)處理 HeLa細(xì)胞和HCerEpiC細(xì)胞培養(yǎng)基使用含有10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，并放入37℃、5%CO2的常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞每2～3 d傳代1次，傳代時(shí)用胰酶使細(xì)胞懸浮，并用DMEM培養(yǎng)基洗滌2次，將細(xì)胞懸液按1∶3稀釋后傳代。細(xì)胞蛋白提取前，預(yù)先2 h在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入10 nmol/L PEDF蛋白或按推薦濃度加入LY294002、GSK 690693（30 μmol/L）、740 Y-P（50 g/L）或 IGF-1（100 mg/L）。筆者所在研究團(tuán)隊(duì)的前期結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HeLa細(xì)胞在使用 PEDF 濃度梯度（1、5、10、20和 40 nmol/L）處理后，10 nmol/L的PEDF劑量對(duì)HeLa細(xì)胞活性和侵襲相關(guān)蛋白水平的抑制作用最顯著，低于或者高于10 nmol/L的劑量對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制作用均低于10 nmol/L（結(jié)果尚未發(fā)表），因此在本研究中使用PEDF的濃度為10 nmol/L。

1.4 免疫組織化學(xué)ABC法和染色結(jié)果判定 取得宮頸癌組織及癌旁組織樣本后，立即于10%甲醛溶液中固定過(guò)夜，經(jīng)梯度酒精脫水，浸二甲苯和石蠟，然后進(jìn)行包埋，切成4 μm的切片，存放于4℃冰箱備染。

1.4.1 免疫組織化學(xué)ABC方法 二甲苯脫蠟、梯度酒精水化；3%H2O2室溫10 min滅活內(nèi)源性酶；磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后，進(jìn)行高壓加熱抗原修復(fù)；恢復(fù)室溫后，PBS清洗切片，用檢測(cè)抗體所對(duì)應(yīng)的血清封閉30 min，加一抗后4℃過(guò)夜；次日依次滴加生物素化二抗及ABC試劑，室溫下各孵育30 min，PBS清洗；DAB顯色；蘇木素復(fù)染；鹽酸酒精分化后脫水、透明，封片晾干，于倒置熒光顯微鏡的明場(chǎng)下觀察分析。

1.4.2 免疫組織化學(xué)染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 染色強(qiáng)度分為4個(gè)等級(jí)：無(wú)著色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分；染色面積分為4個(gè)等級(jí)：陽(yáng)性細(xì)胞占0～5%計(jì)0分，6%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，50%以上計(jì)3分；染色最后得分為染色強(qiáng)度與染色面積的乘積：0～1分為陰性，2～5分為弱陽(yáng)性，6～8分為中陽(yáng)性，9分為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.5 細(xì)胞活性測(cè)定（CCK-8法） 細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，按104/孔的數(shù)量將細(xì)胞懸液接種到96孔板中，每孔100 μL。培養(yǎng) 24 h后，將 10 μL 的 2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-（2，4-二磺基苯）-2H-四氮唑單鈉鹽（WST-8）添加到各孔中，再孵育1 h。通過(guò)酶標(biāo)儀對(duì)所有孔的吸光度（OD）值進(jìn)行測(cè)量，從而計(jì)算細(xì)胞活性。細(xì)胞活性=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%。

1.6 蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）檢測(cè) 將各組細(xì)胞置于冰上，加入4℃的預(yù)冷RIPA細(xì)胞蛋白裂解液，提取細(xì)胞全蛋白，蛋白濃度定量檢測(cè)采用二喹啉甲酸（BCA）法。蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳（電壓：濃縮膠200 V，分離膠100 V；時(shí)間約90 min）后，進(jìn)行半干轉(zhuǎn)膜[時(shí)間：（蛋白分子量+5）min，電壓 40 V]。隨后加入 5%的脫脂奶粉-TBST封閉液于室溫封閉2 h，再分別加入按1∶1 000比例稀釋的 PEDF、PI3K、p-Akt、Akt、c-Met和 β-actin 一抗，4 ℃輕搖過(guò)夜；第2天加入相應(yīng)二抗（1∶100比例稀釋），在37℃恒溫下?lián)u床避光孵育2 h。最終蛋白的相對(duì)表達(dá)量用待測(cè)蛋白灰度值/β-actin灰度值計(jì)算得出。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)，3組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；定性資料采用例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。所有檢驗(yàn)均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癌旁組織和宮頸癌組織樣本中蛋白表達(dá)水平及評(píng)分 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：癌旁組織樣本中的PEDF蛋白多為棕褐色，呈強(qiáng)陽(yáng)或中陽(yáng)性（7～9分）；PI3K和磷酸化Akt（p-Akt）蛋白多為淺黃色，均為弱陽(yáng)性（2～3分和2～5分），見(jiàn)圖1（見(jiàn)封三）。而在宮頸癌組織切片中PEDF蛋白著色明顯變淡，多為棕黃色，呈弱陽(yáng)性或中陽(yáng)性（4～7分），這說(shuō)明在宮頸癌組織中PEDF蛋白的表達(dá)降低；而PI3K和p-Akt蛋白均顯濃棕褐色，為強(qiáng)陽(yáng)或中陽(yáng)性（8～9分），表明宮頸癌組織中的PI3K/Akt信號(hào)通路被顯著激活。

圖2 HCerEpiC、HeLa、HeLa+PEDF細(xì)胞中PEDF、PI3K、p-Akt和c-Met的蛋白表達(dá)情況

2.2 PEDF抑制HeLa細(xì)胞中PI3K/Akt通路并降低細(xì)胞活性和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá) 通過(guò)Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在人正常宮頸上皮HCerEpiC細(xì)胞中的PEDF表達(dá)較高，而在人宮頸癌HeLa細(xì)胞中PEDF水平顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖 2。此外，HeLa細(xì)胞中的PI3K/Akt信號(hào)通路較HCerEpiC細(xì)胞顯著激活（P＜0.01）。HeLa細(xì)胞中的 c-Met表達(dá)較HCerEpiC細(xì)胞顯著增加（P＜0.01）。使用10 nmol/L PEDF處理HeLa細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的PI3K、p-Akt和c-Met蛋白的表達(dá)均顯著降低（P＜0.01）。而且HeLa細(xì)胞的活性經(jīng)PEDF處理也被顯著抑制（P＜0.01），見(jiàn)表1。

2.3 PEDF通過(guò)PI3K/Akt雙重抑制作用降低HeLa細(xì)胞的活性和侵襲相關(guān)蛋白水平 在HeLa+PEDF組中添加PI3K激活劑740 Y-P并無(wú)法使下游的p-Akt表達(dá)增加，且c-Met蛋白水平和細(xì)胞活性也沒(méi)有增加。而當(dāng)使用Akt激活劑IGF-1時(shí)，HeLa細(xì)胞內(nèi)的c-Met蛋白水平和細(xì)胞活性較Hela+PEDF組均有顯著提升（P＜0.01）。見(jiàn)圖3和表2。

2.4 PEDF的抗腫瘤作用機(jī)制并不限于PI3K/Akt通路的抑制 使用PI3K抑制劑LY294002和Akt抑制劑GSK690693來(lái)對(duì)比PEDF對(duì)PI3K/Akt通路的抑制作用，結(jié)果表明LY294002和GSK690693對(duì)PI3K/Akt通路的抑制程度與PEDF的抑制作用相當(dāng)。然而，LY294002和GSK690693對(duì)HeLa細(xì)胞活性和侵襲相關(guān)蛋白水平的抑制作用不如PEDF明顯（P＜0.01）。見(jiàn)圖4和表3。

表1 HCerEpiC、HeLa、HeLa+PEDF 細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞活性比較（±s，n=10）

表1 HCerEpiC、HeLa、HeLa+PEDF 細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞活性比較（±s，n=10）

注：**與 HCerEpiC 細(xì)胞組比較，P＜0.01，##與 HeLa細(xì)胞組比較，P＜0.01。

組別 PEDF PI3K p-Akt Akt c-Met 細(xì)胞活性（%）HCerEpiC 82.34±8.61 16.84±2.11 11.21±1.93 71.30±3.32 9.88±6.77 96.75±3.44 HeLa 14.36±3.52** 71.43±3.35** 68.93±2.03** 13.34±3.97** 64.54±7.69** 98.88±2.57 HeLa+PEDF 79.37±6.35 13.90±2.88## 10.89±2.82## 65.32±3.02## 9.12±5.42## 36.77±8.92##F 425.2 1 614.0 1 949.0 1 202.0 187.5 344.1 P＜0.000 1 ＜0.000 1 ＜0.000 1 ＜0.000 1 ＜0.000 1 ＜0.000 1

圖3 HeLa細(xì)胞經(jīng)PEDF、PI3K激活劑或Akt激活劑處理后蛋白表達(dá)水平變化

表2 HeLa+PEDF、HeLa+PEDF+740Y-P、HeLa+PEDF+IGF-1細(xì)胞中蛋白的水平變化及細(xì)胞活性變化 （±s，n=10）

表2 HeLa+PEDF、HeLa+PEDF+740Y-P、HeLa+PEDF+IGF-1細(xì)胞中蛋白的水平變化及細(xì)胞活性變化 （±s，n=10）

注：**與HeLa+PEDF細(xì)胞組比較，P＜0.01。

組別 PI3K p-Akt Akt c-Met 細(xì)胞活性（%）HeLa+PEDF 13.54±2.42 13.24±2.12 73.36±4.32 9.23±3.02 34.73±7.77 HeLa+PEDF+740 Y-P 84.03±3.12** 12.39±2.43 71.28±3.61 9.67±2.71 31.12±6.63 HeLa+PEDF+IGF-1 12.45±3.03 59.45±1.99** 9.60±4.12** 82.12±6.29** 74.28±6.08**F 2 980.0 1 732.0 799.4 1 151.0 171.3 P＜0.000 1 ＜0.000 1 ＜0.000 1 ＜0.000 1 ＜0.000 1

圖4 HeLa細(xì)胞經(jīng)PEDF或PI3K/Akt抑制劑處理后蛋白的表達(dá)情況

表3 HeLa+PEDF、HeLa+LY294002+GSK690693細(xì)胞中蛋白水平及細(xì)胞活性的對(duì)比（±s，n=10）

表3 HeLa+PEDF、HeLa+LY294002+GSK690693細(xì)胞中蛋白水平及細(xì)胞活性的對(duì)比（±s，n=10）

組別 PI3K p-Akt Akt c-Met 細(xì)胞活性（%）HeLa+PEDF 11.28±2.01 14.11±2.61 74.62±5.12 10.03±2.69 31.19±5.28 HeLa+LY294002+GSK690693 10.08±3.38 13.27±3.06 78.96±4.31 28.72±3.10 59.31±8.27 t 0.96 0.66 2.05 14.41 9.06 P 0.348 0 0.517 4 0.055 4 ＜0.000 1 ＜0.000 1

3 討論

在全球女性惡性腫瘤中，宮頸癌的發(fā)病率僅次于乳腺癌和結(jié)直腸癌，而在發(fā)展中國(guó)家婦女中其發(fā)病率則在惡性腫瘤中排第一位[11]。目前宮頸癌的治療主要是手術(shù)、放療和（或）放療，但晚期宮頸癌對(duì)化療不敏感且已失去手術(shù)意義。傳統(tǒng)的化療藥物在延長(zhǎng)宮頸癌患者生存期和提高生活質(zhì)量方面的效果不佳且不良反應(yīng)嚴(yán)重[12]，所以近年來(lái)探索針對(duì)宮頸癌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的靶向藥物已成為研究熱點(diǎn)。PI3K作為RAS信號(hào)通路的下調(diào)因子，是一種常見(jiàn)的受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)脂類激酶[13]。PI3K激活后可將膜脂磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸鹽（Ptd Ins[4，5]P2）轉(zhuǎn)化成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸鹽（Ptd Ins[3，4，5]P3），Akt和磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）又通過(guò)直接與Ptd Ins[3，4，5]P3結(jié)合而被募集到 PI3K 活性位點(diǎn)[14]，且PDK1與Ptd Ins[3，4，5]P3結(jié)合促進(jìn)了Akt的磷酸化[15]，導(dǎo)致其下游蛋白的磷酸化，從而發(fā)揮一系列下游效應(yīng)。PI3K/Akt信號(hào)通路與宮頸癌的相關(guān)研究一直以來(lái)都備受關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路參與人宮頸癌細(xì)胞的增殖、分化以及凋亡的調(diào)節(jié)[16]；而PI3K/Akt/核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的遷移和侵襲起重要作用[17]。

由于宮頸癌細(xì)胞中有顯著的PI3K/Akt通路激活現(xiàn)象，使PI3K/Akt抑制劑用于治療宮頸癌成為可能。常見(jiàn)的PI3K抑制劑有wotrmannin、槲皮素、LY294002和吲哚-3-甲醇等，而Akt抑制劑主要有GSK 690693、MK-2206、SC-66和木黃酮。最近有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/mTOR雙重抑制劑BEZ235可有效地阻斷HeLa細(xì)胞中PI3K和mTOR的活化，并以時(shí)間和濃度相關(guān)的方式抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞停滯在G1期并發(fā)生凋亡[18]。PI3K/mTOR的雙重抑制劑有較多好處，其在抑制PI3K激酶的同時(shí)又能作用于非PI3K依賴的靶點(diǎn)mTOR上，且可以避免產(chǎn)生負(fù)反饋環(huán)路導(dǎo)致mTOR抑制劑效果不佳[19]。

PEDF具有顯著地抑制血管內(nèi)皮增殖、遷移和促進(jìn)凋亡作用[20]。近年來(lái)，PEDF的抗新生血管生成作用在抗腫瘤方面的研究也逐漸被重視。研究表明，PEDF可導(dǎo)致腫瘤組織內(nèi)的血管生成減少，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和分化；此外，PEDF可直接針對(duì)腫瘤組織的血管抑制而并不影響周圍健康組織的血管新生[21]。PEDF可使宮頸癌組織中微血管密度和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)顯著下降，說(shuō)明PEDF抑制宮頸癌組織生長(zhǎng)的作用有一部分是通過(guò)下調(diào)VEGF 實(shí)現(xiàn)的[22]。

本研究發(fā)現(xiàn)了PEDF在宮頸癌方面新作用，即雙重抑制PI3K/Akt通路從而下調(diào)HeLa細(xì)胞的活性和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)。本研究表明PEDF不但能抑制PI3K的活性，且在PEDF存在的情況下加入PI3K激活劑并不能激活下游Akt的活性，這說(shuō)明PEDF對(duì)Akt的活性也有抑制作用。據(jù)報(bào)道，PEDF在有些組織中可激活PI3K/Akt通路繼而發(fā)揮下游效應(yīng)[23]。推測(cè)這可能是PEDF的組織特異性導(dǎo)致PEDF在不同組織中對(duì)PI3K/Akt產(chǎn)生不同的作用。此外，本研究對(duì)PEDF與PI3K/Akt抑制劑進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，PEDF對(duì)HeLa的細(xì)胞活性和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響大于PI3K/Akt抑制劑。這說(shuō)明PEDF的抗腫瘤效果可能更優(yōu)于單純的PI3K/Akt抑制劑，而造成這一現(xiàn)象的可能原因是PEDF的抗新生血管作用，但PEDF是否還有別的抗腫瘤機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究揭示了PEDF抑制了宮頸癌HeLa細(xì)胞中PI3K/Akt通路的激活，進(jìn)而調(diào)節(jié)HeLa細(xì)胞的活性和侵襲相關(guān)蛋白水平。本研究所發(fā)現(xiàn)的PI3K/Akt通路抑制現(xiàn)象拓寬了PEDF在抗腫瘤方面的機(jī)制和運(yùn)用，為宮頸癌的防治策略提供了有益的理論依據(jù)。