陳敏，王明珠，劉增佑

子癇前期（pre-eclampsia，PE）是一種全身多系統(tǒng)不適的妊娠期特異性疾病，臨床表現(xiàn)為妊娠20周以后出現(xiàn)尿蛋白、高血壓、內(nèi)皮細胞功能異常、異常血管反應等功能紊亂，嚴重者可導致孕婦及胎兒死亡[1]。目前PE發(fā)病機制尚不明了，研究表明子宮螺旋動脈重鑄不良、胎盤滋養(yǎng)層和靶器官內(nèi)皮功能障礙、系統(tǒng)性炎癥反應等與PE發(fā)病關系密切[2]。miR-210是一種微小RNA（microRNA，miRNA），在 PE 患者胎盤中異常表達[3]。缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是調(diào)節(jié)PE患者胎盤缺氧代謝平衡的重要轉(zhuǎn)錄因子，研究表明HIF-1α在PE患者胎盤中表達水平顯著升高[4-5]。本研究通過檢測研究對象胎盤中miR-210和HIF-1α表達水平及血壓、尿蛋白等臨床生化指標，分析miR-210和HIF-1α在PE患者胎盤中表達的相關性及對PE發(fā)病的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院（我院）2016年1月—2018年2月收治的46例PE孕婦為研究對象，根據(jù)國際診斷標準[6]分組，輕度子癇前期患者21例設為輕度組、重度子癇前期患者25例設為重度組。另取同期在我院孕檢正常并在妊娠結(jié)束行剖宮產(chǎn)的孕婦34例為對照組，年齡23～30歲，平均（26.87±5.19）歲，孕周 31～41 周，平均（36.45±4.08）周。3組研究對象在年齡、孕周及體質(zhì)量指數(shù)（BMI）等基本資料方面差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性（P＞0.05），詳見表1。納入標準：①以剖宮產(chǎn)終止妊娠患者；②單胎、初產(chǎn)孕婦；③同意配合研究，簽署知情同意書。排除標準：①合并其他產(chǎn)科并發(fā)癥及其他內(nèi)科合并癥患者；②心臟病、高血壓及家族遺傳病史患者；③自然陰道分娩患者；④有血液性疾病病史患者；⑤胎盤早剝、胎兒宮內(nèi)窘迫、發(fā)育遲緩患者。

表1 3組基本資料比較（±s）

表1 3組基本資料比較（±s）

組別n年齡（歲）孕周（周）BMI（kg/m2）對照組 34 26.87±5.19 36.45±4.08 27.54±5.79輕度組 21 26.96±5.28 37.51±3.62 27.31±5.63重度組 25 27.48±5.92 36.85±3.86 27.88±6.11 F 0.098 0.481 0.056 P 0.907 0.621 0.946

1.2 研究方法

1.2.1 胎盤中miR-210、HIF-1α mRNA表達水平測定 孕婦進行剖宮產(chǎn)時，胎盤娩出30 min內(nèi)取胎盤絨毛膜組織，用0.9%氯化鈉沖洗干凈并吸干表面水分，置于-80℃保存?zhèn)溆?。行胎盤總RNA提取，然后按照Thermo Fisher公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟合成互補脫氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA），miR-210以 U6為內(nèi)參，HIF-1α 以 β-actin為內(nèi)參進行定量聚合酶鏈反應（PCR），條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火45 s，64℃延伸15 s，共進行40個反應循環(huán)。引物序列見表2。

表2 定量PCR引物序列

1.2.2 胎盤中HIF-1α表達測定 孕婦進行剖宮產(chǎn)時，胎盤娩出30 min內(nèi)取胎盤母體面中央組織，大小約為1 cm×1 cm×1 cm，經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋后，進行4 μm切片處理，采用免疫組織化學染色法（SP），按照染色步驟進行。

結(jié)果判定：每個切片至少選擇10個高倍視野，當在顯微鏡下觀察到細胞核中或胞質(zhì)內(nèi)可見較為清晰的棕黃色顆粒時判定為陽性。染色強度計分：細胞核或胞漿中有大量棕色或褐色顆粒沉著計3分，有較多棕黃色顆粒沉著計2分，少量淡黃色顆粒沉著計1分，未染色計0分；單位視野范圍內(nèi)陽性細胞所占百分比計分：＞80%計4分，60%～80%計3分，40%～60%計2分，20%～40%計1分，＜20%計0分。染色強度為兩者積分乘積：0分為陰性（-），1～4分為弱陽性（+），5～8分為中等陽性（++），9～12分為強陽性（+++）。陰性和弱陽性為HIF-1α低表達，中等陽性和強陽性為HIF-1α高表達。

1.2.3 常規(guī)指標檢測 測定研究對象的BMI、收縮壓（systolic blood pressure，SBP）、舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）和尿蛋白（protein，PRO）情況。

1.3 統(tǒng)計學方法 運用統(tǒng)計學軟件SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行處理。定性資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；定量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t或SNK-q檢驗；采用Pearson法分析miR-210與HIF-1α在PE患者胎盤組織中表達相關性；受試者工作特征（ROC）曲線分析miR-210與HIF-1α對PE的診斷價值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PE患者臨床指標檢測結(jié)果分析 3組SBP、DBP、PRO比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。其中重度組患者SBP、DBP、PRO水平高于輕度組和對照組（P＜0.05），輕度組患者 SBP、DBP、PRO 水平高于對照組（P＜0.05）。見表 3。

表3 生化指標檢測結(jié)果分析比較（±s）

表3 生化指標檢測結(jié)果分析比較（±s）

注：#與對照組相比，P＜0.05；*與輕度組相比，P＜0.05。1 mmHg=0.133 kPa。

組別 n SBP（mmHg） DBP（mmHg） PRO（g/L）對照組 34 125.05±33.24 80.03±11.22 0.16±0.03輕度組 21 149.36±33.61# 94.72±17.48# 1.09±0.38#重度組 25 162.28±39.75#* 113.86±21.89#* 1.11±0.47#*F 8.376 29.169 81.086 P 0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.2 胎盤中miR-210、HIF-1α mRNA相對表達量3組患者miR-210、HIF-1α mRNA相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與對照組相比，輕度組患者胎盤中miR-210、HIF-1α mRNA相對表達量升高（P＜0.05）；與對照組、輕度組相比，重度組PE患者胎盤中miR-210、HIF-1α mRNA相對表達量升高（P＜0.05）。見表 4。

表4 胎盤中miR-210、HIF-1α mRNA相對表達量（±s）

表4 胎盤中miR-210、HIF-1α mRNA相對表達量（±s）

注：#與對照組相比，P＜0.05；*與輕度組相比，P＜0.05。

組別 n miR-210 HIF-1α mRNA對照組 34 0.73±0.22 1.01±0.13輕度組 21 1.64±0.31# 1.72±0.35#重度組 25 2.21±0.76#* 2.30±0.59#*F 72.643 82.637 P＜0.001 ＜0.001

2.3 胎盤中HIF-1α表達 胎盤組織中HIF-1α在胎盤組織中呈陽性表達，染色呈黃色、棕褐色、褐色，見圖1（見后插二）。3組HIF-1α陽性表達率差異有統(tǒng)計學意義（χ2=26.190，P=0.000），重度組 PE 患者胎盤組織中HIF-1α陽性表達率高于輕度組和對照組（χ2分別為 4.061 和 25.555，P＜0.05），輕度組患者胎盤組織中HIF-1α陽性表達率高于對照組（χ2=9.198，P＜0.05），見表 5。

表5 胎盤中HIF-1α表達[n（%）]

2.4 胎盤中miR-210和HIF-1α表達與PE患者臨床指標的關系 胎盤中miR-210和HIF-1α表達與PE患者年齡、孕周和BMI無關（P＞0.05），與SBP、DBP、PRO水平和 PE嚴重程度有關（P＜0.05），見表6。

表6 胎盤中miR-210和HIF-1α表達與PE患者臨床指標的關系

2.5 PE患者胎盤中miR-210和HIF-1α表達的相關性 經(jīng)Pearson法分析顯示，PE患者胎盤中miR-210與 HIF-1α 表達呈正相關（n=46，r=0.892，t=13.09，P＜0.05），見圖 2。

圖2 PE患者胎盤中miR-210和HIF-1α表達的相關性分析

2.6 ROC分析miR-210、HIF-1α表達水平對PE的診斷價值 結(jié)果顯示，miR-210的ROC曲線下面積（AUC）為 0.726，95%CI為 0.615～0.820，敏感度為80.43%，特異度為70.59%，截斷值為1.06；HIF-1α的 AUC為0.769，95%CI為 0.661～0.856，敏感度為78.26%，特異度為82.35%，截斷值為1.27，見圖3（見后插二）。

3 討論

PE是由遺傳代謝、免疫反應及氧化應激等多種因素引起的功能性疾病，病因復雜，發(fā)病率高，可導致患者出現(xiàn)血管痙攣、臟器供血不足、胎盤組織缺氧等癥狀，引起胎兒發(fā)育不良，甚至死亡。胎盤是胎兒與母體發(fā)生營養(yǎng)交換的場所，妊娠早期絨毛膜外滋養(yǎng)層細胞增殖、分化并入侵母體子宮肌層螺旋動脈壁，啟動血管重鑄，形成循環(huán)脈管系統(tǒng)，建立物質(zhì)交換場所，滿足胎兒對血液及氧氣等物質(zhì)需求[7]。胎盤缺血缺氧可導致絨毛膜外滋養(yǎng)層細胞入侵較淺，血管重鑄出現(xiàn)障礙，影響胎盤功能。近年研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α可調(diào)控滋養(yǎng)層細胞低氧適應性變化，參與PE低氧反應基因表達調(diào)節(jié)[8]。在HIF-1α信號通路中，miR-210可通過互補配對結(jié)合到HIF-1α的3′非翻譯區(qū)，進而調(diào)控HIF-1α翻譯，HIF-1ɑ能夠與miR-210轉(zhuǎn)錄起始位點處低氧反應元件結(jié)合，進而調(diào)控miR-210表達[9]。本研究通過對PE患者胎盤中miR-210和HIF-1α表達水平進行檢測，分析miR-210和HIF-1α在PE患者胎盤中表達相關性及與PE患者臨床病理的關系，為提高臨床診療效果提供參考。

MiRNA可與靶mRNA發(fā)生堿基互補配對，影響其翻譯，促使靶基因降解，調(diào)控基因表達，參與細胞增殖、分化、遷移和凋亡等生命過程[10]。研究表明，PE患者胎盤中含有大量異常表達的miRNA，其中以低氧標志miR-210最為顯著，miR-210可通過靶基因調(diào)控細胞代謝、DNA修復、血管生成過程[11]。胎盤組織中miR-210在缺氧環(huán)境下可抑制滋養(yǎng)層細胞增殖、分化及遷移，限制細胞新陳代謝，影響胎盤中線粒體呼吸作用，參與PE發(fā)生、發(fā)展[12]。焦秋香等[13]研究表明，miR-210在重度PE患者血清和胎盤組織中呈異常表達，因此認為miR-210的異常表達可通過調(diào)控其靶基因參與PE患者病理生理過程。本研究結(jié)果表明，隨著PE患者嚴重程度的增加，miR-210相對表達量呈現(xiàn)上升的趨勢，且明顯高于對照組，本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果基本一致，提示miR-210相對表達量隨胎盤缺氧程度的增加而升高，由此推測miR-210可能作為PE患者胎盤缺氧的分子標記物參與PE疾病發(fā)生、發(fā)展，但是由于本研究僅研究miR-210在胎盤組織中的表達情況，并未研究其在血清中表達情況，因此還有待從不同角度探討miR-210與PE的關系。

HIF-1α作為缺氧調(diào)節(jié)通路中關鍵環(huán)節(jié)，最早由Semenza[14]作為連接在基因缺氧反應元件上的核因子而發(fā)現(xiàn)，是細胞在應激缺氧環(huán)境下產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄激活因子。胎盤組織缺氧可誘導HIF-1α高表達，與細胞質(zhì)中穩(wěn)定表達的HIF-1β結(jié)合形成二聚體，維持胎盤內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，改善胎盤組織缺氧耐受以適應低氧變化[15-16]。陳光雪等[17]研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在妊娠期高血壓疾病中高表達，與妊娠期高血壓疾病發(fā)生有密切關系。本研究結(jié)果顯示，PE患者胎盤組織中HIF-1α水平顯著高于對照組，且隨著PE患者疾病嚴重程度的增加，HIF-1α水平呈上升趨勢，推測胎盤中HIF-1α表達異?？赡芘cPE疾病發(fā)生、發(fā)展有關。Duette等[18]研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α也可以調(diào)控細胞因子分泌，影響滋養(yǎng)細胞功能，如刺激胎盤生長因子分泌，加重血管內(nèi)皮損傷并妨礙其再修復過程，引起胎盤血管重鑄障礙，加劇PE進展。但是由于本研究不深入，關于HIF-1α在PE發(fā)生、發(fā)展中具體作用機制還有待進一步研究。

本研究結(jié)果還顯示，胎盤中miR-210和HIF-1α表達與PE患者年齡、孕周和BMI無關，與SBP、DBP、PRO水平和PE嚴重程度呈正相關，說明隨著PE患者SBP、DBP和PRO水平升高，胎盤中miR-210和HIF-1α表達均明顯升高，且隨著PE嚴重程度的加重，miR-210和HIF-1α表達水平隨之升高，提示PE患者胎盤組織中miR-210和HIF-1α表達與PE疾病發(fā)展有關。本研究還顯示，PE患者胎盤中miR-210和HIF-1α表達水平呈正相關，分析原因可能為二者通過某種機制共同參與PE疾病發(fā)展。Merlo等[19]研究顯示，miR-210是缺氧誘導因子明確的目標，HIF-1α蛋白能夠通過miR-210途徑參與調(diào)控細胞代謝過程及其基因表達。Korkes等[9]研究子癇前期和非高血壓患者HIF-1α、可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體1（sFlt-1）與miR-210的關系中顯示，sFlt-1與miR-210呈正相關，但是HIF-1α與miR-210無顯著相關性，此結(jié)果與本研究結(jié)果不同，分析可能是由于本研究納入樣本量較少以及地區(qū)不同而造成的。關于PE患者胎盤中二者的相互作用機制尚不明確，還有待深入分析。最后，本研結(jié)果顯示miR-210、HIF-1α表達水平均對PE具有較高的敏感度及特異度，提示miR-210和HIF-1α可能作為臨床診斷及治療PE的潛在分子標記物。

綜上，miR-210和HIF-1α在PE患者胎盤組織中高表達，二者表達水平呈正相關，與患者SBP、DBP、PRO水平及PE嚴重程度有關，推測miR-210和HIF-1α可能參與PE疾病發(fā)生、發(fā)展。通過檢測PE患者miR-210和HIF-1α表達水平有助于臨床早期診斷，并可為PE治療方案的制定提供參考。但關于miR-210和HIF-1α在PE發(fā)生及發(fā)展過程中的具體作用機制有待深入研究。