王國(guó)臻 王玉格 王憲鈺 馬麗 王彬 李天園

【摘 要】霍亂是由霍亂弧菌所引起的烈性腸道傳染病，其傳播速度極快，發(fā)病急，屬于國(guó)際檢疫傳染病，其被我國(guó)列為甲類傳染病。霍亂的快速檢測(cè)顯得極其重要，現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外有很多檢測(cè)霍亂弧菌的方法。主要是傳統(tǒng)的檢測(cè)方法及分子生物學(xué)和免疫學(xué)的方法，本文主要對(duì)近幾年最新的霍亂弧菌檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

【關(guān)鍵詞】霍亂弧菌；檢測(cè)技術(shù)；分子生物學(xué)；免疫學(xué)

霍亂是一種烈性腸道傳染病，霍亂的病原體—霍亂弧菌（Vibrio cholerae）經(jīng)人工培養(yǎng)呈桿狀或彎曲弧狀，有鞭毛能運(yùn)動(dòng)的革蘭陰性菌。霍亂弧菌由于O抗原的不同，被分為155個(gè)血清群，主要是O1群和O139群可導(dǎo)致霍亂的發(fā)生，其他血清型尚未發(fā)現(xiàn)可致霍亂，O1群和O139群主要引起感染者劇烈嘔吐，腹瀉，失水，肌肉痙攣甚至死亡。所以霍亂弧菌的快速檢測(cè)顯得極其重要。國(guó)內(nèi)外學(xué)者建立了大量應(yīng)用廣泛的檢測(cè)技術(shù)。其中傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)，生化檢測(cè)以及血清學(xué)檢測(cè)等作為常規(guī)的檢測(cè)方法被應(yīng)用。近來(lái)，分子生物學(xué)，免疫學(xué)和倆者結(jié)合的技術(shù)越來(lái)越成熟，以其快速簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確性高，特異性極強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。

1.霍亂弧菌的致病機(jī)理及流行情況

產(chǎn)生霍亂毒素的霍亂弧菌為產(chǎn)毒株，其主要致病毒素是霍亂腸毒素，霍亂弧菌的致病物質(zhì)與其染色體上的多個(gè)基因有關(guān)，主要致病因子有三個(gè)，a.CTX基因原件，b.TCP致病性島，c.ToxR，霍亂腸毒素是由A亞單位和B亞單位構(gòu)成的一個(gè)多聚體蛋白，當(dāng)人或動(dòng)物感染后，B亞單位可與攻擊對(duì)象的小腸黏膜上皮細(xì)胞上的受體結(jié)合，然后A亞單位進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致一系列酶反應(yīng)發(fā)生，然后引起腸道分泌功能亢進(jìn)，引起大量液體及血漿中的大量電解質(zhì)進(jìn)入腸腔，由于分泌功能超過(guò)腸道的重吸收能力，從而導(dǎo)致人體嚴(yán)重的腹瀉，由于脫水和電解質(zhì)缺失，引起循環(huán)衰竭，血壓下降繼而腦供血不足，然后缺氧昏迷；更甚者不發(fā)生嘔吐和腹瀉癥狀，直接進(jìn)入中毒性休克而死亡。

2.檢測(cè)方法

2.1傳統(tǒng)的檢測(cè)方法

霍亂弧菌兼性厭氧，營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單，在堿性蛋白胨水或平板上生長(zhǎng)良好，所形成的菌落無(wú)色透明，扁平或稍凸起，邊緣整齊?，F(xiàn)國(guó)內(nèi)已有許多選擇培養(yǎng)基，如TCBS等。其生化反應(yīng)氧化酶陽(yáng)性，過(guò)氧化物酶陽(yáng)性，吲哚反應(yīng)陽(yáng)性。能發(fā)酵多種單糖，雙糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，發(fā)酵乳糖遲緩，不分解阿拉伯糖、水楊素等?；魜y弧菌在無(wú)鹽的生存環(huán)境中也可生活，其他菌則不能。

2.2分子生物學(xué)方法

2.2.1 PCR-激光誘導(dǎo)熒光-毛細(xì)血管電泳檢測(cè)方法

此方法以毛細(xì)血管電泳法和激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器結(jié)合用以檢測(cè)霍亂弧菌，此方法首先讓霍亂弧菌腸毒素CTXA基因來(lái)選擇引物，然后利用PCR法擴(kuò)增霍亂弧菌的特異性基因片段，所得到的PCR產(chǎn)物，然后利用高效毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光快速檢測(cè)，此方法對(duì)毛細(xì)血管電泳法和PCR條件進(jìn)行了改良，用以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。在改良的PCR條件下，霍亂弧菌的CTXA基因有效擴(kuò)增，無(wú)特異性條帶；擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序發(fā)現(xiàn)其與基因庫(kù)的序列同源性比匹配度幾乎達(dá)到100%，其檢測(cè)結(jié)果與普通凝膠電泳法一致。此方法優(yōu)點(diǎn)明顯，所需的檢驗(yàn)樣品少，非?？焖伲⒌募夹g(shù)先進(jìn)，可應(yīng)用于科研等專業(yè)實(shí)驗(yàn)室。

2.2.2環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一項(xiàng)非常特殊的技術(shù)，它可以針對(duì)基因的多個(gè)區(qū)域然后設(shè)計(jì)不同的特異性引物，然后在鏈置換DNA聚合酶的作用下，進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，15到60min左右即可實(shí)現(xiàn)十的九次方倍的核酸擴(kuò)增，目前已有人開(kāi)展相關(guān)研究，這種方法應(yīng)用于霍亂弧菌的檢測(cè)時(shí)，是利用霍亂弧菌外膜蛋白的ompW基因設(shè)計(jì)特異性引物，建立霍亂弧菌的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)方法，同時(shí)對(duì)霍亂弧菌進(jìn)行擴(kuò)增，然后檢測(cè)其靈敏度和特異性，此技術(shù)與普通PCR法進(jìn)行比較，反應(yīng)速度極快， 而且反應(yīng)結(jié)果都可以通過(guò)肉眼直接觀察斷定，實(shí)驗(yàn)顯示此檢測(cè)辦法靈敏度極高，特異度為100%?？捎糜谑称贩矫娴臋z測(cè)，與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法比大大縮短了檢測(cè)的時(shí)間，靈敏度高，其可直接用于霍亂弧菌的現(xiàn)場(chǎng)流行學(xué)檢查。

2.3免疫學(xué)方法

2.3.1近紅外免疫層析法

近紅外免疫層析法的建立用以快速檢測(cè)O1群霍亂弧菌，其借鑒近紅外熒光探針的定量免疫層析試紙條，其建立的技術(shù)基礎(chǔ)為低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的O1群霍亂弧菌免疫層析試紙條，利用了近紅外免疫層析技術(shù)，雙抗體夾心法檢測(cè)O1群霍亂弧菌，然后制造靶向O1群霍亂弧菌的免疫層析的試紙條，此方法順應(yīng)了使用更高靈敏度的標(biāo)記物替代膠體金顆粒的發(fā)展趨勢(shì)，其檢測(cè)結(jié)果快速準(zhǔn)確，特異性強(qiáng)，此方法與普通膠體金方法相比較，其靈敏度提高了100倍，極大的提高檢驗(yàn)檢疫效率。

2.3.2膠體金免疫層析法

膠體金免疫層析法可對(duì)霍亂弧菌O1群和O139群進(jìn)行快速檢測(cè)，膠體金免疫層析法運(yùn)用膠體金免疫層析技術(shù)，以雙抗體夾心法檢測(cè)霍亂弧菌O1群和O139群，然后對(duì)此方法進(jìn)行其靈敏度，特異性等方面的對(duì)比，與細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)多份臨床標(biāo)本相比較該方法能在十分鐘內(nèi)完成檢測(cè)，此方法具有操作簡(jiǎn)便快速，靈敏度高，不需任何儀器設(shè)備、能夠同時(shí)檢測(cè)大量樣品等優(yōu)點(diǎn)。可用于進(jìn)出口的檢測(cè)。

3.結(jié)語(yǔ)

綜上所述，分子生物學(xué)和免疫學(xué)方法對(duì)霍亂弧菌的檢測(cè)都有著良好的靈敏度和特異性，能達(dá)到快速檢測(cè)的目的。分子生物學(xué)方面，隨著引物與探針的設(shè)計(jì)更精確，其檢測(cè)技術(shù)也越來(lái)越成熟，因成本低，效率高等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用；免疫學(xué)方面，因操作簡(jiǎn)單，工作量大，檢測(cè)快速等優(yōu)點(diǎn)也被廣泛推廣。我們應(yīng)該將其與分子生物學(xué)與免疫學(xué)相結(jié)合，然后再確定病原體，相信不久的將來(lái)，人們可以發(fā)現(xiàn)更多的方式檢測(cè)霍亂弧菌，為霍亂弧菌的早期檢測(cè)和臨床治療提供更多的有價(jià)值的信息。

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