酉鵬華,王軍偉,何曉敏

(1.陜西省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，西安 710068；2.西安理工大學(xué)醫(yī)院，西安 710068)

隨著年齡的增加，心房顫動(dòng)發(fā)病率明顯增加[1-2]。年齡是心房顫動(dòng)發(fā)生、發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。心房肌電生理異常是心房顫動(dòng)的發(fā)病及維持機(jī)制，其中電重構(gòu)起著極其非常重要的作用。心房顫動(dòng)電重構(gòu)是指快速不規(guī)則的心房激動(dòng)造成的心房肌電生理特性改變，表現(xiàn)為心房有效不應(yīng)期及動(dòng)作電位時(shí)程的縮短，心房內(nèi)傳導(dǎo)速度減慢等[3]。大量的證據(jù)顯示電重構(gòu)對(duì)維持心房顫動(dòng)起著非常重要的作用，心房電重構(gòu)主要表現(xiàn)和機(jī)制是離子通道重構(gòu)，離子通道相應(yīng)基因的改變及電流密度的改變與心房顫動(dòng)發(fā)生相關(guān)。瞬時(shí)外向鉀電流(Ito)屬于鈣依賴性的外向鉀電流,心房肌復(fù)極1期主要是瞬時(shí)外向鉀電流內(nèi)流的結(jié)果。Kv1.4鉀通道和Kv4鉀通道(包括Kv4.2鉀通道和Kv4.3鉀通道)構(gòu)成Ito的α亞基，Kv4.3鉀通道在心房比較豐富，Kv4.2鉀通道在心室比較豐富，一般多將Kv4.3鉀通道作為Ito的編碼基因。Ito是心房肌細(xì)胞復(fù)極的主要電流，參與動(dòng)作電位1期的復(fù)極，與0期去極化電流共同形成動(dòng)作電位的峰電位，決定動(dòng)作電位平臺(tái)期起始的高度。老年人心房顫動(dòng)高發(fā)病率是否與鉀通道增齡性改變有關(guān)尚不明確。本研究就增齡對(duì)家兔心房組織Kv4.3鉀通道基因表達(dá)的變化進(jìn)行研究，為增齡是心房顫動(dòng)發(fā)生的危險(xiǎn)因素提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康實(shí)驗(yàn)家兔24只，雌雄不限，按月齡分為3組：幼年組8只，日齡14～21 d，平均(18.6±2.1)d，平均體質(zhì)量(240.0±30.0)g；成年組8只，月齡8～10個(gè)月，平均(9.0±0.9)個(gè)月，平均體質(zhì)量(2.0±0.3)kg；老年組8只，月齡30～35個(gè)月，平均(32.8±1.8)個(gè)月，平均體質(zhì)量(4.0±0.5)kg。幼年組和成年組購于西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，老年組購于四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本獲取 取出家兔，稱體質(zhì)量，成年組、老年組使用20%烏拉坦以6 mL/kg的劑量經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉，幼年組以3%戊巴比妥30 mg/kg劑量腹腔內(nèi)注射麻醉。將家兔仰臥位于實(shí)驗(yàn)手術(shù)臺(tái)上，開胸將心臟暴露，取下心臟，分離心臟纖維膜及結(jié)締組織，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)沖洗血跡，沿冠狀溝分離心房和心室，并分離左右心房，分別保存于凍存管中，置于液氮中急冷，存于-80 ℃冰箱中保存以備用。

1.2.2心房組織Kv4.3鉀通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定基因表達(dá)的變化 兔心房組織總RNA提取采用Trizol RNA提取方法。檢測RNA濃度及純度：NanoDropDN-100全波長紫外分光度計(jì)測定方法測定總RNA濃度和OD260/OD280比值，OD值在1.8～2.0為純度較高，可以進(jìn)行下一步反轉(zhuǎn)錄操作。使用TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。具體條件：37 ℃ 15 min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))，85 ℃ 5 s(反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng))，合成cDNA。以NCBI GenBank提供的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)及KCND3引物序列，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，引物序列如下，GAPDH：上游-3′-GCT TTT AAC TCT GGC AAA GTG-5′，下游-3′-GAT GAT GAC CCT TTT GGC TC-5′；KCND3：上游-3′-GCC GCA GTA AGA AGA CCA CAC-5′，下游-3′-TTG GTC TCA GTC CGT CGT CTG-5′；按照TaKaRa實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒操作說明書進(jìn)行反應(yīng)，采用3步法PCR擴(kuò)增程序：第1步95 ℃ 30 s；第2步95 ℃ 30 s，62 ℃(GAPDH、KCND3)、62.5 ℃(KCND3)30 s 72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；第3步59.5 ℃變性1 min，然后冷卻至55 ℃。從55 ℃開始每一步增加0.5 ℃，持續(xù)30 s，直至95 ℃，總共81步，讀取吸光值，進(jìn)行溶解曲線分析，記錄CT值。以溶解曲線為單峰示引物特異性較強(qiáng)，反應(yīng)特異性較高。使用20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物是否特異，見單一的擴(kuò)增條帶，無引物二聚體等其他非特異性條帶，表明擴(kuò)增反應(yīng)特異。

2 結(jié) 果

2.1不同年齡組Kv4.3鉀通道KCND3相對(duì)表達(dá)水平比較 幼年組KCND3基因相對(duì)表達(dá)水平為6.14，成年組為12.29，老年組為14.57，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2不同年齡組間Kv4.3鉀通道KCND3表達(dá)水平多重比較 幼年組KCND3基因表達(dá)水平為(1.23±0.64)，成年組為(3.12±1.80)，老年組為(4.78±2.67)。與幼年組比較，成年組及老年組表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而成年組與老年組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

a:P<0.05，與幼年組比較

圖1不同年齡組家兔心房組織Kv4.3鉀通道(KCND3)多重表達(dá)水平比較

2.3Kv4.3鉀通道KCND3及GAPDH mRNA的轉(zhuǎn)錄 Kv4.3鉀通道KCND3 mRNA轉(zhuǎn)錄圖見圖2，Kv4.3鉀通道基因及GAPDH的PCR產(chǎn)物電泳帶位置與理論值相符。

1～4:KCND3;5:Marker;KCND3：165 bp

圖2Kv4.3鉀通道KCND3mRNA轉(zhuǎn)錄圖

3 討 論

國內(nèi)外眾多流行病學(xué)研究均顯示年齡與心房顫動(dòng)發(fā)生密切相關(guān)[4]。美國弗萊明翰心臟中心關(guān)于心房顫動(dòng)的回顧性調(diào)查顯示：眾多危險(xiǎn)因素中老齡居首位，是心房顫動(dòng)發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[5]。促使心房顫動(dòng)發(fā)生和維持的重要因素是心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)，而結(jié)構(gòu)重構(gòu)與電重構(gòu)相互影響并相互作用，結(jié)構(gòu)重構(gòu)可促發(fā)電重構(gòu)，使老齡患者心房顫動(dòng)發(fā)病率增加[6-7]；心房電重構(gòu)的電生理機(jī)制是離子通道重構(gòu)，目前大量研究均證實(shí)離子通道重構(gòu)是發(fā)生心房顫動(dòng)發(fā)病因素之一[8-10]，增齡可使心房離子通道基因、蛋白及電流水平均發(fā)生變化，是引起老齡心房電重構(gòu)的電生理基礎(chǔ)。心房肌Kv4.3鉀通道(Ito電流)參與心房復(fù)極1期及0期去極化過程，二者共同形成動(dòng)作電位峰電位，影響動(dòng)作電位形狀、時(shí)程及有效不應(yīng)期變化。老年人心房顫動(dòng)高發(fā)病率是否與鉀通道增齡性改變相關(guān)目前研究尚不明確。

產(chǎn)生Ito電流的Kv鉀通道主要有Kv4.2鉀通道和Kv4.3鉀通道，Kv4.3鉀通道在心房分布較豐富，Kv4.3鉀通道主要產(chǎn)生Ito電流[11]。編碼Kv4.3鉀通道的基因是KCND3，Ito電流是動(dòng)作電位早期復(fù)極1期的主要離子流，與0期去極化共同形成動(dòng)作電位峰電位，其大小對(duì)動(dòng)作電位形態(tài)和時(shí)程有較大的影響。Ito電流的升高，將會(huì)加快1期復(fù)極，縮短動(dòng)作電位時(shí)程和有效不應(yīng)期，參與心房顫動(dòng)電重構(gòu)。目前的研究中，大部分發(fā)現(xiàn)心房顫動(dòng)時(shí)Ito電流改變，而且Kv4.3鉀通道基因和蛋白水平均同步改變，與Ito電流密度改變一致，并認(rèn)為Kv4.3鉀通道m(xù)RNA改變是Ito電流改變的分子機(jī)制。而YUE等[12-13]在心房顫動(dòng)犬模型中發(fā)現(xiàn)電流密度及其主要編碼基因Kv4.3鉀通道m(xù)RNA表達(dá)水平改變，并與心房電重構(gòu)有關(guān)。

隨著年齡的增加，心臟在解剖結(jié)構(gòu)和電生理功能等方面也將發(fā)生變化，這些改變將參與心房顫動(dòng)發(fā)生和發(fā)展。LIU等[14]研究提示Ito電流密度隨年齡增長增高。DUN等[15]研究了心房組織Ca2+通道及Ito、Isus電流的增齡性變化，也發(fā)現(xiàn)Ito電流隨年齡增長而增高。本研究選擇了編碼Kv4.3鉀通道的基因KCND3作為目的基因，結(jié)果顯示KCND3表達(dá)存在增齡性上調(diào)，與DUN等[15]細(xì)胞電生理Ito研究結(jié)論相一致；其中，幼年組與中年組和老年組分別比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。通道基因表達(dá)是通道電流的改變的分子機(jī)制，電流水平與基因水平一致。因此筆者推測Kv4.3基因表達(dá)的升高，可能將促使Ito電流升高，使復(fù)極1、2期加速，從而縮短動(dòng)作電位時(shí)程和有效不應(yīng)期及降低2期平臺(tái)期高度,可能是心房顫動(dòng)電重構(gòu)的一個(gè)環(huán)節(jié)。

本研究顯示成年組與老年組KCND3基因表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但老年組有不斷上升的趨勢，分析原因如下：心房顫動(dòng)發(fā)病率隨年齡增加而增加，60歲發(fā)病率開始增高，>80歲發(fā)病率為10%，老年組發(fā)病率更高，本實(shí)驗(yàn)老年組家兔為30～35個(gè)月齡，而家兔正常生命周期為6～8年，從家兔的生理年齡來看，30～35個(gè)月齡家兔屬于老齡下限，因受實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)時(shí)間的限制，目前國內(nèi)外關(guān)于老齡家兔研究中，把大于30月齡的家兔定為老齡，若研究對(duì)象的年齡進(jìn)一步增大，可能會(huì)出現(xiàn)不同的結(jié)果。