金衛(wèi)華，張瑞濤

0 引言

據(jù)國家癌癥中心數(shù)據(jù)顯示，2014年全國女性乳腺癌新發(fā)病例約27.89萬例，占女性惡性腫瘤發(fā)病的16.51%；發(fā)病率為41.82/10萬，死亡率為9.90/10萬，近10年乳腺癌死亡率呈上升趨勢[1]，乳腺癌相關(guān)研究對于促進女性健康具有積極意義。全外顯子組僅占人類基因組的1%~2%，其中與人類疾病有關(guān)的基因突變約占85%。全外顯子測序是利用序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進行高通量測序的基因組分析方法，該方法相對其他測序方法有效率高、成本低等優(yōu)勢[2]，在當今基因研究中應(yīng)用廣泛，在包括乳腺癌在內(nèi)的各種復雜疾病研究中發(fā)揮著重要作用，特別是運用新一代測序技術(shù)進行基因組DNA序列分析和風險預測為乳腺癌的研究做出了積極貢獻，本文就全外顯子測序在乳腺癌的發(fā)病機制、診斷及治療中的研究進行綜述，了解其在解析乳腺癌發(fā)病分子機制等方面的研究進展。

1 全外顯子測序在乳腺癌發(fā)病機制中的研究進展

1.1 乳腺癌遺傳易感性與基因突變的研究

乳腺癌具有明確的遺傳易感性，大部分遺傳性乳腺癌表現(xiàn)為家族聚集性，約占所有乳腺癌的5%~10%[3]。除了經(jīng)典的BRCA家族外，Kechagioglou等[4]研究發(fā)現(xiàn)，PTEN與乳腺癌發(fā)生有關(guān)。Noh等[5]使用外顯子組測序，發(fā)現(xiàn)了XCR1、DLL1、TH、ACCS、SPPL3、CCNF和SRL7個基因變種存在于無BRCA突變的乳腺癌家族。也有研究表明家族性乳腺癌的遺傳易感性可以是民族特異性的。Kim等[6]通過全外顯子測序研究認為埃及乳腺癌家族的遺傳易感性可能與其他疾病人群不同，并支持全面篩查當?shù)丶膊〖易濉？傊怙@子測序能更為精確地分析乳腺癌遺傳易感基因，不斷有明確的易感基因被發(fā)現(xiàn)，為分析乳腺癌易感基因多態(tài)性及其相互作用提供了新的思路和方法。

基因突變是腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ)，大量學者從基因突變的角度研究乳腺癌的發(fā)病機制。Banerji等[7]報告了103例來自墨西哥和越南不同亞型乳腺癌患者的DNA全外顯子組序列，以及22例乳腺癌/正常配對的全基因組序列。除了確認PIK3CA、TP53、AKT1、GATA3和MAP3K1的復發(fā)性體細胞突變之外，還發(fā)現(xiàn)CBFB轉(zhuǎn)錄因子基因的復發(fā)性突變和RUNX1的缺失；確定了富含三陰乳腺癌的復發(fā)性MAGI3-AKT3融合體，其缺乏雌激素和黃體酮受體以及ERBB2表達?；蛲蛔冾愋桶ㄥe義突變和移碼突變等，關(guān)于乳腺癌的基因突變類型，F(xiàn)oo等[8]研究報告了一種新型PALB2變體c.104T>C（p.L35P），研究結(jié)果將L35P確定為PALB2中的第一個致病性錯義突變。Radmanesh[9]等對6例家族性乳腺癌白血病患者的基因組DNA樣本進行了外顯子組測序，并發(fā)現(xiàn)了一個移碼突變APOBEC3B*c.783delG，其顯示出與乳腺癌適度相關(guān)。基因突變還會影響腫瘤轉(zhuǎn)移。Ng等[10]對來自9位患者的原發(fā)性乳腺癌和同步遠處轉(zhuǎn)移瘤進行了兩次解剖學上不同的核心活組織檢查，伴有轉(zhuǎn)移性疾病的患者進行了高深度的全外顯子測序。在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性沉積物之間觀察到基因組差異，共有體細胞突變的中位數(shù)為60%（范圍為6%~95%）。影響上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因（包括SMAD4、TCF7L2和TCF4（ITF2））的致病性突變被限制或富集于轉(zhuǎn)移性病變中。

全外顯子測序研究基因突變在罕見乳腺癌的發(fā)病機制中也有重要作用。Dieci等[11]將全外顯子測序應(yīng)用于三種不同的罕見乳腺癌亞型，對29例微乳頭、23例化生和27例多形小葉乳腺癌進行了整個外顯子和有針對性的測序。微乳頭乳腺癌表現(xiàn)出與常見乳腺癌相當?shù)奶卣鳎篜IK3CA、TP53、GATA3和MAP2K4是最常見的突變基因?；腿橄侔┏尸F(xiàn)TP53（78%）和PIK3CA（48%）突變的高頻率，并在KDM6A（13%）（一種參與組蛋白去甲基化的基因）上反復發(fā)生突變。 27例樣本中有8例樣本在多形性小葉癌中表現(xiàn)出PIK3CA（30%）、TP53（22%）和CDH1（41%）的高突變率，并且表現(xiàn)為PYGM（一種參與糖原代謝的基因）高表達。多形性小葉癌的測序鑒定出PYGM的高比例改變。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了糖原代謝在乳腺癌進展中的作用。

總之，外顯子測序是進行基因突變檢測直觀、準確、高效的方法之一，能夠檢測出乳腺癌患者基因突變的類型和位置，對于部分罕見的亞型，外顯子測序更有針對性，能夠進行更加透徹的研究。

1.2 乳腺癌異質(zhì)性研究

乳腺癌具有異質(zhì)性，全外顯子測序在其異質(zhì)性研究中也有重要意義。腫瘤的異質(zhì)性研究有較大難度，通過外顯子測序，能夠探尋突變與異質(zhì)性發(fā)生的相關(guān)性，對異質(zhì)性在乳腺癌發(fā)病中的作用能夠進行深入研究。Ma等[12]從癌癥基因組圖譜評估了916名女性乳腺癌患者。使用突變等位基因腫瘤異質(zhì)性（MATH）算法來測量腫瘤內(nèi)異質(zhì)性（ITH）并探索其與臨床參數(shù)和多組學數(shù)據(jù)的相關(guān)性。研究結(jié)果揭示了ITH在乳腺癌中的臨床特征和遺傳的相關(guān)性。Kato等[13]采用全外顯子測序分析乳腺癌患者腫瘤組織的體細胞突變、腫瘤浸潤淋巴細胞的T細胞受體β庫譜，以及15個不同位點的免疫相關(guān)基因的表達，結(jié)果表明腫瘤中高體細胞突變負荷與免疫原性抗原的數(shù)量相關(guān)，功能性激活腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）具有更高的細胞溶解活性。乳腺癌有復雜的腫瘤異質(zhì)性，可能與誘導癌癥特異性TIL密切相關(guān)并影響腫瘤中的免疫微環(huán)境。

三陰性乳腺癌（TNBC）是一種高度異質(zhì)性和侵襲性的疾病，由于腫瘤的異質(zhì)性，難以發(fā)現(xiàn)有效的生物標志物來識別這些患者。Jiang等[14]對MD安德森癌癥中心（MDACC）的29例TNBC病例進行了全外顯子組測序，分析顯示AR和FOXA1調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的突變（其中BRCA1起關(guān)鍵作用）使患者對蒽環(huán)類/紫杉烷化療的敏感度顯著增高，提出將BRCA缺陷與增加的克隆變異負荷聯(lián)系起來，并顯著增強TNBC的化療敏感度。提示我們可以通過針對遺傳異質(zhì)情況優(yōu)化的新型高通量分析策略來研究罕見變異在癌癥發(fā)展中的作用。

1.3 乳腺癌轉(zhuǎn)移中的研究

乳腺癌發(fā)展到后期會轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移的途徑難以分析。通過外顯子測序，能夠分析腫瘤的轉(zhuǎn)移過程是如何進行、轉(zhuǎn)移過程中是否有新的突變產(chǎn)生，還能分析腫瘤轉(zhuǎn)移的起源等。Kr?ig?rd等[15]將全外顯子組測序和靶向深度測序應(yīng)用于來自6名轉(zhuǎn)移性雌激素受體（ER）陽性乳腺癌患者的26個連續(xù)樣品。結(jié)果指出了三種不同的轉(zhuǎn)移途徑，包括轉(zhuǎn)移的線性進展、線性和平行進展向轉(zhuǎn)移的共同發(fā)生、轉(zhuǎn)移—轉(zhuǎn)移播種。另外還在研究中發(fā)現(xiàn)突變，僅在轉(zhuǎn)移灶中發(fā)現(xiàn)的突變影響CREBBP和PPP2R1A基因，其已經(jīng)作為癌癥相關(guān)基因包含在癌癥體細胞突變目錄（COSMIC）癌癥基因調(diào)查列表。該研究首次報道了通過乳腺癌進展的連續(xù)步驟，建立轉(zhuǎn)移克隆起源，揭示轉(zhuǎn)移性擴散的復雜模式，詳細描述突變的演變。Savas等[16]研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性與轉(zhuǎn)移性疾病及不同轉(zhuǎn)移部位間的亞克隆結(jié)構(gòu)具有顯著的異質(zhì)性，在每種情況下均發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性交叉播種，并且治療推動了亞克隆多樣化，強調(diào)了形成轉(zhuǎn)移性乳腺癌基因組的各種機制以及詳細研究晚期疾病的價值。

2 全外顯子測序在乳腺癌診斷中的研究進展

2.1 診斷標志物研究

全外顯子測序可用于乳腺癌診斷的標志物研究。Heidary等[17]對來自58名轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的74份血漿DNA樣本進行分析，并且通過全基因組測序鑒定血漿中的拷貝數(shù)變化，對原發(fā)腫瘤、轉(zhuǎn)移瘤和循環(huán)腫瘤細胞進行了全基因組、外顯子組或靶向深度測序，研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）的動態(tài)范圍顯著不同，可使用ctDNA作為預測性和預后性生物標志物。Lesurf等[18]研究發(fā)現(xiàn)，與基底樣或正常亞型乳腺癌患者相比，HER2陽性患者更有可能完全緩解，而ERBB2和GRB7基因融合的病例不容易完全緩解。

2.2 診斷方法的研究

Wang等[19]開發(fā)了一種稱為nuc-seq的全基因組和外顯子組單細胞測序方法，對來自ER陽性乳腺癌和三陰性導管癌的單個正常細胞核和腫瘤細胞核進行測序，同時進行單核拷貝數(shù)分析，可用于乳腺癌的診斷。Kriegsmann等[20]設(shè)計并驗證了乳腺癌特異性基因芯片，用于基于半導體的測序，證明在常規(guī)環(huán)境中乳腺癌靶向熱點測序是可行的，并能產(chǎn)生可靠的、臨床上有意義的結(jié)果。

2.3 全外顯子測序?qū)τ谠\斷技術(shù)的評價

Fusco等[21]對乳腺腺樣囊性瘤進行全外顯子測序分析，并探討分子分析在乳腺腺樣囊性瘤診斷中的作用（區(qū)別顯示MYB表達的良性腫瘤和CYLD基因突變）。結(jié)果表明組織病理學和分子學方法的整合可以幫助區(qū)分低惡性潛能和良性乳腺腫瘤三重陰性表型。Kim等[22]采用全外顯子測序數(shù)據(jù)評估拷貝數(shù)變化（CNA）估計工具（ExomeCNV、CoNIFER、VarScan2、CODEX、ngCGH、SaasCNV和falcon）的一致性和敏感度，結(jié)果顯示SaasCNV具有最高的一致性（65.0%）、敏感度（69.4%）和特異性（89.1%）?？筛倪MCNA檢測算法，準確解釋人類癌癥的全外顯子測序結(jié)果?？傊?，可以通過外顯子測序研究乳腺癌的腫瘤標志物，在測序的基礎(chǔ)上研究乳腺癌的診斷方法，提高診斷的準確率，評價診斷結(jié)果的可靠性。

3 全外顯子測序在乳腺癌治療中的研究進展

目前研究較多的是對三陰性乳腺癌的治療。Pfefferle等[23]利用小鼠Trp53缺失的乳腺移植瘤模型進行人和鼠腫瘤之間的比較。研究鑒定了五種潛在的個體化藥物靶基因，它們是鼠類和人類基底樣腫瘤中自發(fā)擴增的基因座：Cul4a，Lamp1，Met，Pnpla6和Tubgcp3。使用克唑替尼抑制Met導致Met擴增的鼠腫瘤完全消退。該研究將Met鑒定為小鼠腫瘤的藥物靶標，從而鑒定與人類基底樣乳腺癌子集潛在的共同驅(qū)動因子，也強調(diào)了比較基因組研究對于發(fā)現(xiàn)個性化藥物靶點的意義，為進一步研究關(guān)鍵腫瘤信號通路提供了臨床前模型。Liu等[24]通過全外顯子測序，鑒定Trp53單獨或與Brca1結(jié)合驅(qū)動的TNBC小鼠模型中的體細胞遺傳改變。全外顯子測序和人類TNBC上RNA測序的組合將用于TNBC治療的精確藥物指導，支持針對個體腫瘤的遺傳學治療方案，這些方案與正在進行的NCI-MATCH、My Pathway實驗和ESMART臨床試驗方法類似。Lesurf等[18]研究認為可通過全外顯子測序，預測對化療和曲妥珠單抗治療無效的HER2陽性乳腺癌患者。總之，通過外顯子測序，鑒定乳腺癌治療的藥物靶標，有利于乳腺癌的精準治療。

4 展望

全外顯子測序技術(shù)的進步使醫(yī)學研究走向了“基因醫(yī)學”時代，該技術(shù)在乳腺癌中的應(yīng)用也越來越多，主要有以下幾點：（1）由于與疾病相關(guān)的大部分功能性變異基本集中在染色體的外顯子區(qū)，全外顯子測序可以有效發(fā)現(xiàn)乳腺癌的致病基因或易感基因；（2）發(fā)掘腫瘤轉(zhuǎn)移機制，全面揭示疾病的發(fā)生發(fā)展機制；（3）研究乳腺癌在基因水平上的臨床診斷，開發(fā)新的診斷技術(shù)，早期準確診斷乳腺癌并預測疾病預后；（4）尋找乳腺癌的治療靶點，促進疾病的個體化治療。

然而，外顯子測序依然存在局限，如部分腫瘤是由于基因結(jié)構(gòu)變異導致，并不會改變堿基序列；少量基因變異在染色體末端的重復區(qū)域內(nèi)；部分疾病是由于線粒體基因突變導致；內(nèi)含子基因突變引起疾病等均無法通過外顯子測序監(jiān)測；部分疾病是由于基因之間的相互作用導致，單純的基因突變并不能完全解釋疾病。

在今后的研究中，可充分利用外顯子測序的優(yōu)點為乳腺癌的研究提供幫助。