丁路，孫榮鑫，白靖平

0 引言

骨肉瘤（Osteosarcoma, OS）是骨中常見的原發(fā)性侵襲性腫瘤，好發(fā)于兒童和青少年[1-2]。像其他肉瘤一樣，OS是一種間質細胞來源的惡性腫瘤[3]，它通常是局部侵襲性的，早期有全身轉移傾向[4]。目前的治療策略包括術前化療（新輔助化療）、手術切除和術后（輔助）化療?；熀笤跓o轉移的局部性骨肉瘤患者中5年無瘤生存率達到60%~70%，但是中晚期骨肉瘤患者的5年生存率則低于50%[5]。研究表明，遺傳變異在骨肉瘤發(fā)生與發(fā)展的不同階段起著重要作用，腫瘤抑制基因突變與致癌基因活化與骨肉瘤密切相關[6]。因此，了解骨腫瘤發(fā)生的分子機制，以及驗證骨肉瘤的新治療靶點對于制定骨肉瘤的治療有著重要意義。

本研究通過轉染siRNA的方法敲低U2OS細胞中Skp2的表達，研究骨肉瘤中Skp2對細胞生長、凋亡以及細胞周期的影響；同時探討Skp2對骨肉瘤細胞遷移和侵襲的調控作用。進一步檢測沉默Skp2是否影響E-cadherin、Akt及周期蛋白p21和p27。初步探討Skp2對骨肉瘤細胞生物學行為的影響，闡明Skp2作為骨肉瘤治療靶點的意義。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑

人骨肉瘤U2OS購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，將其置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。MTT（3-（4,5-二甲苯并噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物）為美國Sigma公司產(chǎn)品?？?p21、抗p27、抗-E-cadherin、抗-Akt和抗-pAkt多克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。Tubulin及Skp2多克隆抗體均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。Lipofectamine 2000購自美國Thermo Fisher Scientific公司。Annexin V/PI雙染試劑盒購自北京碧云天試劑有限公司，鈣黃綠素乙酰甲酯（Calcein-AM）染色試劑盒購自美國Invitrogen公司。

1.2 細胞轉染

將生長狀態(tài)良好的U2OS細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)大約24 h，待細胞融合度達到70%~80%后，用Lipofectamine 2000分別轉染Skp2 siRNAs及對照siRNA。Skp2 siRNA由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。轉染5~8 h后棄培養(yǎng)液，再加入2 ml新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48~72 h。收集細胞檢測基因沉默效率用于后續(xù)實驗。

1.3 RT-qPCR檢測

按照TRIzol試劑使用說明提取轉染細胞的RNA并反轉錄合成cDNA。Skp2引物序列為：上游：5'-GCT GCT AAA GGT CTC TGG TGT-3'，下游：5'-AGG CTT AGA TTC TGC AAC TTG-3；GAPDH引物序列為：上游：5'-ACC CAG AAG ACT GTG GAT GG-3'，下游：5'-CAG TGA GCT TCC CGT TCA G-3'，以GAPDH表達作內部參照。通過SDS軟件分析Skp2基因表達，溶解曲線全部為單峰表明為特異性擴增，用2-ΔΔCt方法分析Skp2基因表達變化。

1.4 蛋白質印跡分析

收集處理的細胞，加入適量的含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取總蛋白， 用Bradford法檢測蛋白質濃度并制樣。以相同的量將蛋白樣品加載到每個泳道中，用SDS-PAGE凝膠電泳。將經(jīng)SDSPAGE分離的蛋白質轉移到NC膜上。室溫下用5%牛奶封閉NC膜1 h。洗NC膜3~5次，分別用Skp2、p-Akt（ser473）、p21、p27、E-cadherin和Tubulin等第一抗體進行孵育，4℃過夜。洗膜，然后再與辣根過氧化物酶標記的二級抗體進行室溫孵育90 min左右。用ECL顯影液將目的蛋白表達條帶顯影于X光片上。用Quantity One軟件掃描目的蛋白表達條帶進行灰度分析，對比Tubulin蛋白表達量獲得目的蛋白的相對表達量，最后對結果進行統(tǒng)計分析。

1.5 MTT測定

收集對數(shù)期U2OS細胞將細胞制成細胞懸液，以5×103個/孔接種到96孔板中，培養(yǎng)過夜。轉染siRNA，每組設5個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)48和72 h。每孔加0.5%MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。加入150 μl DMSO，置搖床上室溫低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解，利用酶標儀檢測OD490 nm處各孔的吸光度。分別在48 h和72 h通過MTT測定細胞活力，確定Skp2對骨肉瘤細胞中細胞增殖的調節(jié)作用，從而評估Skp2 siRNA轉染骨肉瘤細胞增殖的狀況。

1.6 細胞凋亡測定

將轉染細胞培養(yǎng)至6孔板中，48 h后收集細胞并用PBS洗滌，加入500 μl結合緩沖液懸浮細胞，再先后加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl（PI），避光反應15 min，用FACScan流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.7 細胞周期分析

將轉染siRNA的U2OS細胞及對照細胞接種到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)48 h。收集細胞在磷酸鹽緩沖液中洗滌一遍，再用70%冷乙醇固定12 h。次日，用冷PBS洗滌細胞，以1×106個/毫升重懸于PBS中。用核糖核酸酶A（RNase A, 0.1 mg/ ml）于37℃下處理固定的細胞20~30 min。1 000 r/min離心5 min收集細胞，將細胞重新懸浮于熒光染料PI（50 μg/ml）中，使用FACScan流式細胞儀評估細胞周期分布并進行分析。

1.8 Transwell侵襲和遷移實驗

細胞侵襲實驗：將轉染細胞按5×105個/毫升懸浮于無血清DMEM培養(yǎng)基中，取0.2 ml細胞懸液加入到事先輔有Matrigel的Transwell上室中；下室中加入0.5 ml含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；將Transwell板放到培養(yǎng)箱內，培養(yǎng)24 h。用鑷子取出Transwell小室，留在膜上層未穿膜的細胞用棉簽輕輕擦去。將膜取出，底面朝上放到24孔板小孔內，加入適量Hanks緩沖液，再加入4 μg/ml Calcein-AM，將侵入Matrigel基質膜及侵入未鋪Matrigel的Transwell小室膜的細胞在37℃下染色1 h。在熒光顯微鏡下進行拍照，各組細胞隨機選取6個不同的視野，對穿過膜的侵襲細胞進行計數(shù)。

細胞遷移實驗：將轉染細胞鋪在不加Matrigel的Transwell小室膜上，其余操作步驟與細胞侵襲實驗相同。

1.9 統(tǒng)計學方法

實驗結果采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料主要采用均數(shù)±標準差進行描述，用t-test分析比較Skp2 siRNA轉染組和NC siRNA轉染組之間的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 骨肉瘤細胞U2OS中轉染Skp2 siRNA后對Skp2表達的影響

RT-qPCR結果顯示，Skp2 siRNA轉染U2OS細胞48 h后，三條siRNA序列都顯著下調Skp2 mRNA水平，其中siRNA3序列下調效果最為顯著（0.21±0.03, P=0.0001），與對照組相比，Skp2在U2OS細胞中的敲除效率均達到70%左右，見圖1A。Western blot結果表明三條siRNA均能有效的敲低Skp2蛋白表達，而siRNA3在U2OS細胞中沉默效果為79%，強于siRNA1的59%和siRNA2的74%，見圖1B。因此，后續(xù)實驗沉默Skp2的表達時均轉染siRNA3。

2.2 沉默Skp2后對骨肉瘤細胞增殖的影響

研究表明，通過降低Skp2水平可抑制多種癌細胞增殖。MTT結果表明，在轉染Skp2 siRNA 48 h，U2OS細胞生長受到一定程度的抑制，抑制率為34%（P=0.0065），見圖2A；而72 h后U2OS細胞生長則被顯著抑制，抑制率為64%（P=0.0003），見圖2B。

2.3 沉默Skp2對骨肉瘤細胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測結果顯示，沉默Skp2表達可觸發(fā)U2OS細胞凋亡。與對照組的凋亡率5.45%及轉染NC siRNA對照組的5.50%相比，轉染Skp2 siRNA的細胞凋亡率增加到18.56%，見圖3。

2.4 沉默Skp2對骨肉瘤細胞周期的影響

流式細胞術結果顯示，Skp2 siRNA轉染組細胞出現(xiàn)典型的G0/G1阻滯。沉默Skp2后，G0/G1期細胞比例從陰性對照組的44.54%，增加到U2OS細胞的76.35%，見圖4。結果表明沉默Skp2表達可誘導骨肉瘤阻滯在G0/G1期。

2.5 下調Skp2表達對骨肉瘤細胞遷移和侵襲的影響

將轉染Skp2 siRNA的細胞鋪在含Matrigel膠的小室膜上，培養(yǎng)大約16 h后，將侵入Matrigel基質膜的細胞用4 μg/ml Calcein-AM在37℃下染色1 h。熒光顯微鏡拍照，對隨機選擇的6個視野進行統(tǒng)計，Transwell實驗結果表明沉默Skp2顯著削弱了U2OS細胞的侵襲能力（23.33±4.71, P=0.0002）；將轉染Skp2 siRNA的細胞鋪在不含Matrigel膠的Transwell小室膜上時，遷移到膜背面的細胞明顯減少，表明沉默Skp2同樣會抑制U2OS細胞的遷移能力（74.71±8.82, P=0.0021）。結果表明，沉默Skp2的表達顯著削弱了U2OS細胞的體外遷移和侵襲能力，見圖5。2.6 骨肉瘤細胞沉默Skp2對其下游分子的影響

圖1 骨肉瘤細胞U2OS中轉染Skp2 siRNA后RT-qPCR和Western blot檢測Skp2的表達Figure1 Skp2 expression in U2OS cells transfected with Skp2 siRNA measured by RT-qPCR and Western blot

圖2 沉默Skp2表達抑制骨肉瘤細胞增殖Figure2 Downregulation of Skp2 expression inhibited proliferation of OS cells

Western blot分析顯示，沉默Skp2可增加骨肉瘤細胞中E-cadherin的表達，升高約2.86倍（2.86±0.07, P=0004）。而沉默Skp2后周期相關蛋白p21和p27的表達也顯著升高，分別升高約1.79倍和2.16倍（1.79±0.06, P=0.0192; 2.16±0.05,P=0.0124），見圖6。表明Skp2在一定程度上可通過靶向p21與p27參與細胞周期調控。沉默Skp2降低了骨肉瘤細胞中p-Akt活性形式分子，p-Akt的表達下降約50%（0.5±0.04, P=0.0027），見圖6。

3 討論

圖3 沉默Skp2對骨肉瘤細胞凋亡的影響Figure3 Depletion of Skp2 induced apoptosis of OS cells

圖4 沉默Skp2對骨肉瘤細胞周期的影響Figure4 Depletion of Skp2 induced cell cycle arrest of OS cells

圖5 沉默Skp2表達抑制骨肉瘤細胞侵襲與遷移能力Figure5 Depletion of Skp2 inhibited migration and invasion of OS cells

Skp2在多種腫瘤中都有高表達，如淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、鼻咽癌、胃癌等[7]。國內外大量研究發(fā)現(xiàn)，Skp2在多種人類腫瘤發(fā)生中主要發(fā)揮癌基因作用，Inuzuka等發(fā)現(xiàn)Skp2通過泛素化破壞E-鈣黏素而增強細胞遷移[8]。Skp2蛋白促進泛素介導的Foxo1水解，在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮關鍵作用[9]。而通過敲除小鼠腫瘤細胞中Skp2的表達則可逆轉由p19 Arf或PTEN蛋白損失引起的腫瘤[10-11]。條件性敲除小鼠Skp2的下調可抑制T細胞譜系和B細胞譜系的淋巴瘤，還可以抑制骨髓、肝臟、乳腺和前列腺中腫瘤的生長[12-14]。鼻咽癌中Skp2高表達與預后不良相關，并且失活Skp2蛋白可通過p21cip/WAF和p27kip促進鼻咽癌細胞衰老[15]。抑制Skp2的表達有助于抑制腫瘤細胞的生長等癌細胞特性[16-17]，但Skp2在骨肉瘤細胞中的作用仍相對模糊。有報道表明骨肉瘤U2OS細胞中Skp2與Cks1紊亂可導致FoxM1表達下調，從而抑制骨肉瘤U2OS細胞生長，進一步導致細胞生長周期阻滯與p21、p27表達水平增加[18]。同時，F(xiàn)oxM1可調節(jié)SCF/SKP2-CKS1泛素鏈接酶復合物等調節(jié)細胞周期基因的轉錄。此外，GLI2是Hedgehog信號通路中的一個關鍵驅動因子，通過siRNA敲低該分子可以抑制骨肉瘤細胞生長，并伴隨細胞周期負調節(jié)分子p21的增加及細胞周期促進分子cyclin D1、Skp2和磷酸化Rb的減少而將細胞阻滯在G1期。相反，過表達GLI2則可通過上調骨肉瘤細胞中Skp2的表達，而促進細胞增殖、加速細胞周期進程。裸鼠移植瘤模型結果表明，敲低GLI2抑制了骨肉瘤在體內的生長[19]。使用環(huán)巴胺（Cyclopamine）特異性的抑制Hedgehog信號途徑中另一關鍵分子Smoothened（SMO），可減緩骨肉瘤細胞生長，上調p21，下調cyclin D1、Skp2等細胞周期促進分子[20]，并且使用SMO shRNA持續(xù)沉默SMO的表達，可抑制骨肉瘤細胞在體內和體外的生長[20]。當用γ-分泌酶抑制劑及阻斷Notch信號通路后，由于cyclin D1、Skp2等細胞周期促進分子表達降低，從而抑制了骨肉瘤細胞體外及體內生長[21]。這些研究表明Skp2在調節(jié)骨肉瘤細胞生長中起關鍵作用。

圖6 沉默Skp2可升高p21、p27、E-cadherin的表達及降低p-Akt的表達Figure6 Depletion of Skp2 increased expression of p27, p27, E-cadherin while decreased p-Akt expression

本研究中我們觀察到Skp2沉默后抑制了骨肉瘤細胞生長、促進凋亡、誘導周期阻滯，并抑制細胞侵襲和遷移能力。Skp2需要通過靶向其底物如p27、p21、p57與FOXO1等來體現(xiàn)其致癌功能，本研究還檢測到Skp2沉默后顯著上調了p21、p27和E-cadherin的表達。相關研究表明，Akt可直接結合Skp2，促進Skp2由細胞核向細胞質遷移，進而激活Skp2功能[22]，并且研究發(fā)現(xiàn)Skp2可刺激人乳腺癌細胞中Akt活化[23]。本研究中，沉默Skp2降低了骨肉瘤細胞中活性形式分子p-Akt的表達，進一步地深入研究將有助于確定Skp2對骨肉瘤細胞中Akt活化的調節(jié)作用。本研究直接證實了Skp2在骨肉瘤細胞中的生物學功能，因此，失活Skp2基因將成為潛在的治療骨肉瘤患者的有效方法。