張化芝，李曉雙，郭曉燁，趙明池

0 引言

乳腺癌是威脅女性生命健康的最常見惡性腫瘤類型，其發(fā)病率及死亡率均居女性惡性腫瘤首位。據(jù)最新全球腫瘤數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，2018年預(yù)計(jì)全球?qū)⒂?10萬乳腺癌新發(fā)患者，約占女性新發(fā)惡性腫瘤數(shù)的四分之一[1-2]。我國乳腺癌患者數(shù)量以每年2%~3%的增長(zhǎng)速率遞增，同時(shí)發(fā)病年齡日趨年輕化，已成為當(dāng)前社會(huì)的重大公共衛(wèi)生問題[3]，尋找潛在的乳腺癌治療藥物對(duì)于乳腺癌的防治具有重要的臨床意義。從臨床已使用的藥物中發(fā)現(xiàn)其新的適應(yīng)證是一種高效的藥物篩選策略，可避免因生物利用度差、不良反應(yīng)高等原因?qū)е碌某伤幮岳щy問題。阿帕替尼（Apatinib）是一種小分子靶向的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR）酪氨酸激酶抑制劑，目前已獲批用于晚期胃腺癌或胃-食管結(jié)合部腺癌患者三線及三線以上臨床治療，可顯著延長(zhǎng)晚期胃癌患者的生存期。經(jīng)檢索得知目前有關(guān)阿帕替尼對(duì)乳腺癌細(xì)胞體內(nèi)外抗腫瘤作用的研究報(bào)道十分有限。本實(shí)驗(yàn)擬通過研究阿帕替尼對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響及其潛在的分子機(jī)制，為阿帕替尼應(yīng)用于乳腺癌的臨床治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫，細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中。常規(guī)培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。

1.2 主要試劑

阿帕替尼（Apatinib, CAS: 1218779-75-9）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青-鏈霉素雙抗溶液及胰蛋白酶購自美國Gibco公司； CCK-8試劑盒（貨號(hào)：C0037）購自碧云天生物科技有限公司（上海，中國）；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：KGA108-1）購自江蘇凱基生物科技有限公司（南京，中國）；乳酸含量檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：MAK064）購自Sigma公司（上海，中國）；糖酵解壓力試劑盒（貨號(hào)：103020-100）購自安捷倫科技（上海）有限公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 CCK-8法檢測(cè)阿帕替尼對(duì)乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞的增殖抑制作用

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞接種于96孔板，接種濃度為4 000個(gè)/孔，待細(xì)胞貼壁后，每孔分別加入不同濃度（0～10 μmol/L）的阿帕替尼藥液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μl 的CCK-8溶液繼續(xù)于培養(yǎng)箱孵育2 h，隨后于多功能酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔吸光度（OD值），并計(jì)算各組細(xì)胞的細(xì)胞活力：細(xì)胞活力=OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組×100%。每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)阿帕替尼對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板，接種密度為3×105個(gè)/孔，待細(xì)胞貼壁后，每孔分別加入不同濃度（0～10 μmol/L）的阿帕替尼藥液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，冷的PBS洗滌細(xì)胞2次后，重懸于100 μl的1×Annexin緩沖液中。隨后每100 μl細(xì)胞樣品加入5 μl的Annexin V及1 μl的PI，37℃水浴鍋中避光孵育30 min后，再加入400 μl的1×Annexin緩沖液稀釋，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各樣本的細(xì)胞凋亡率。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)阿帕替尼對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞Bcl-2及Bax表達(dá)的影響

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板，密度為5×105個(gè)/孔，待細(xì)胞貼壁后，每孔分別加入不同濃度（0～2.5 μmol/L）的阿帕替尼藥液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后采用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，高速離心獲得蛋白樣品。隨后采用Western blot法常規(guī)檢測(cè)不同處理組Bcl-2及Bax的表達(dá)差異，通過計(jì)算灰度值計(jì)算各組中Bcl-2及Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)情況。

1.6 阿帕替尼對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞乳酸產(chǎn)量的影響

不同濃度（0～10 μmol/L）的阿帕替尼藥液作用于MDA-MB-231細(xì)胞24 h后，消化收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組MDA-MB-231活細(xì)胞1×106萬個(gè)，離心得到細(xì)胞沉淀。各組細(xì)胞樣品分別加入150 μl的乳酸實(shí)驗(yàn)專用緩沖液后，對(duì)各組細(xì)胞樣品進(jìn)行超聲破碎。參照試劑盒說明書對(duì)各組樣品中的乳酸含量采用比色法檢測(cè)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組細(xì)胞樣品中乳酸含量的絕對(duì)值。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 阿帕替尼對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞外酸化速率的影響

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞接種于24孔板，接種濃度為5×104個(gè)/孔，待細(xì)胞貼壁后，每孔分別加入不同濃度（0～10 μmol/L）的阿帕替尼藥液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，將糖酵解壓力試劑盒中的3種藥物誘導(dǎo)劑分別加入加藥板上的各加藥孔中，其中葡萄糖、寡霉素及2-脫氧葡萄糖的使用濃度分別為10 mmol/L、1 μmol/L及50 mmol/L。隨后采用細(xì)胞代謝分析儀檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞外酸化速率，并計(jì)算糖酵解能力值及糖酵解保留值。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間數(shù)據(jù)差異性比較采用One-Way ANOVA法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 阿帕替尼濃度依賴性地抑制乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞的增殖

CCK-8法結(jié)果表明，阿帕替尼可濃度依賴性地抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的體外增殖（P=0.003），作用于MDA-MB-231細(xì)胞48 h時(shí)，阿帕替尼對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50值約為1.56 μmol/L。此外，10 μmol/L的阿帕替尼作用于MDA-MB-231細(xì)胞48 h時(shí)，MDA-MB-231細(xì)胞存活率小于5%，見圖1。表明阿帕替尼是一種高效的乳腺癌細(xì)胞殺傷藥物。

圖1 阿帕替尼劑量依賴性地抑制人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖Figure1 Apatinib suppressed proliferation of breast cancer cell line MDA-MB-231 in a does-dependent manner

2.2 阿帕替尼濃度依賴性地誘導(dǎo)乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞凋亡

圖3 阿帕替尼劑量依賴性地誘導(dǎo)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡Figure3 Apatinib induced apoptosis of breast cancer cell line MDA-MB-231 in a does-dependent manner

AnnexinⅤ-FITC/PI雙染結(jié)果表明，阿帕替尼可濃度依賴性地誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡（P=0.001），見圖2、3。同時(shí)Western blot結(jié)果表明，阿帕替尼可增加MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平，下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平，見圖4。上述結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了阿帕替尼體外抗乳腺癌的作用。

圖4 Western blot實(shí)驗(yàn)表明阿帕替尼誘導(dǎo)人乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞的凋亡Figure4 Western blot assay indicated that apatinib could induce apoptosis of breast cancer cell line MDA-MB-231

2.3 阿帕替尼濃度依賴性地抑制乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞內(nèi)乳酸產(chǎn)量

比色法結(jié)果顯示，阿帕替尼可濃度依賴性地降低乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)乳酸產(chǎn)量（P=0.004），見圖5。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)阿帕替尼誘導(dǎo)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡Figure2 Flow cytometry assay indicated that apatinib could induce apoptosis of breast cancer cell line MDA-MB-231

圖5 阿帕替尼濃度依賴性地降低乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)的乳酸產(chǎn)量Figure5 Apatinib significantly decreased lactate production in MDA-MB-231 cells in a does-dependent manner

2.4 阿帕替尼濃度依賴性地抑制乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞的細(xì)胞外酸化速率

為進(jìn)一步證實(shí)阿帕替尼對(duì)乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞有氧糖酵解活性的抑制作用，本研究進(jìn)一步考察了阿帕替尼對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞外酸化速率的影響，細(xì)胞代謝分析儀檢測(cè)結(jié)果顯示阿帕替尼可抑制由寡霉素激活的MDAMB-231細(xì)胞的有氧糖酵解活性（P=0.006），見圖6。進(jìn)一步對(duì)各糖酵解參數(shù)進(jìn)行計(jì)算，阿帕替尼可抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞糖酵解能力值及糖酵解儲(chǔ)備值（P=0.003），見圖7。

3 討論

乳腺癌的發(fā)病率及死亡率均居女性惡性腫瘤首位，嚴(yán)重威脅女性生命健康。據(jù)美國癌癥協(xié)會(huì)估計(jì)，美國女性一生中罹患乳腺癌的概率約為八分之一。盡管自上世紀(jì)90年代起，乳腺癌早期篩查技術(shù)的發(fā)展、輔助化療方案的應(yīng)用、靶向藥物和激素療法聯(lián)合干預(yù)，以及綜合治療體系的進(jìn)步，乳腺癌死亡率下降了39%，但仍僅次于肺癌居女性腫瘤病因死亡率第二位[4]。因此，開發(fā)新的乳腺癌治療藥物或治療策略對(duì)于乳腺癌的防治具有重要的臨床意義及緊迫性。

阿帕替尼是一種小分子的、靶向血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的抗血管生成藥物，已獲批用于晚期胃癌的臨床治療。此外，藥物臨床試驗(yàn)結(jié)果表明阿帕替尼對(duì)于乳腺癌患者也具有較好的抗癌活性，且不良反應(yīng)可控[5]，因此有必要對(duì)阿帕替尼抑制乳腺癌的作用機(jī)制進(jìn)一步深入研究。本研究發(fā)現(xiàn)阿帕替尼可濃度依賴性地抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，且起效濃度較低、活性較強(qiáng)，作用于MDA-MB-231細(xì)胞48 h時(shí)的半數(shù)抑制濃度約為1.56 μmol/L。此外，阿帕替尼可濃度依賴性地誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡，進(jìn)一步驗(yàn)證了阿帕替尼的抗乳腺癌活性。能量代謝是腫瘤細(xì)胞各種惡性生物學(xué)行為改變的基礎(chǔ)。為進(jìn)一步考察阿帕替尼抗乳腺癌作用的分子機(jī)制，本研究首先證實(shí)了阿帕替尼可抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)糖代謝產(chǎn)物乳酸的產(chǎn)量。因乳酸產(chǎn)量增加是腫瘤細(xì)胞代謝表型有氧糖酵解效應(yīng)的主要特征，本研究進(jìn)一步通過實(shí)時(shí)檢測(cè)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的細(xì)胞外酸化速率，證實(shí)了阿帕替尼可降低乳腺癌的糖酵解能力值及糖酵解儲(chǔ)備值，進(jìn)而抑制MDA-MB-231細(xì)胞的有氧糖酵解活性。腫瘤細(xì)胞主要特征之一為增殖加速，該過程意味著腫瘤細(xì)胞需要更多的能量供應(yīng)以滿足快速增殖的需要。因此，有異于正常細(xì)胞的主要供能方式線粒體呼吸，腫瘤細(xì)胞的能量代謝特征主要表現(xiàn)為糖酵解效應(yīng)，即使在有氧條件下，腫瘤細(xì)胞也主要通過糖酵解的方式供能，以滿足快速增殖所需的能量及中間代謝物[6]。鑒于正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞能量代謝模式的差異性，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的糖酵解表型可作為靶向腫瘤細(xì)胞治療的潛在策略[7-8]。已有研究報(bào)道糖酵解抑制劑3-溴丙酮酸體內(nèi)外水平均具有抗乳腺癌活性[9-10]。本研究結(jié)果表明阿帕替尼可能是一種潛在的糖酵解抑制劑，可能通過抑制乳腺癌細(xì)胞的糖酵解過程，進(jìn)而發(fā)揮抗乳腺癌增殖的作用。

圖6 阿帕替尼抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞酸化速率Figure6 Apatinib significantly decreased extracellular acidification rate (ECAR) in MDA-MB-231 cells

圖7 阿帕替尼抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞糖酵解能力值及糖酵解儲(chǔ)備值Figure7 Apatinib significantly decreased glycolytic capacity and glycolytic reserve of MDA-MB-231 cells

綜上所述，阿帕替尼可能通過抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的有氧糖酵解活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮體外水平抗乳腺癌的作用，是一種有潛力的乳腺癌治療藥物。