楊逸璇 朱明芳 王峰 朱亞夢(mèng) 黃曉嬋 楊婉婷

〔摘要〕 目的 探討不同濃度的石榴皮多酚軟膏抗增生性痤瘡瘢痕形成的機(jī)制。方法 SD大鼠36只，于燙傷造模成功后，隨機(jī)分為模型組，陰性對(duì)照組及石榴皮軟膏低劑量組、中劑量組、高劑量組、超高劑量組6組，每組6只。模型組給予生理鹽水濕敷，陰性對(duì)照組涂1 mL基質(zhì)，石榴皮軟膏組按低、中、高、超高劑量組每日分別給予1 mL的相應(yīng)濃度的石榴皮多酚軟膏1次。自造模日起觀察創(chuàng)面情況，并于造模后第7、14、21天分別取各組大鼠創(chuàng)面皮膚進(jìn)行病理組織學(xué)檢測及免疫組化檢測TGF-β1、Smad4水平。結(jié)果 石榴皮多酚軟膏中劑量組能降低TGF-β1、Smad4表達(dá)（P<0.05），抑制瘢痕形成。結(jié)論 石榴皮多酚軟膏可以通過調(diào)控TGF-β/Smad信號(hào)通路抗增生性痤瘡瘢痕的形成。

〔關(guān)鍵詞〕 痤瘡瘢痕;增生性瘢痕;TGF-β/Smad信號(hào)通路;石榴皮多酚

〔中圖分類號(hào)〕R285.5 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.05.007

〔Abstract〕 Objective To investigate the mechanism of different concentrations of pomegranate peel polyphenol ointment in preventing hypertrophic acne scar formation. Methods After successful scald molding， 36 SD rats were randomly divided into a model group， a negative control group， a low dose， a medium dose， a high dose of pomegranate peel ointment group， with 6 rats in each group. The model group was given normal saline wet compress， and the negative control group was coated with 1 mL matrix， and the pomegranate peel ointment group was given 1 mL pomegranate peel polyphenol ointment of the corresponding concentration in the low， medium， high and ultra-high dose groups respectively. The wound condition was observed from the day of model establishment， and the wound skin of rats in each group was taken on the 7th， 14th and 21st day after model establishment for histopathological examination and immunohistochemical detection of transforming growth factor-β1 （TGF-β1） and Smad4 levels. Results The middle dose group of pomegranate peel polyphenol ointment could decrease the expression of TGF-β1 and Smad4 （P<0.05）， and inhibit the formation of scar. Conclusion Pomegranate peel polyphenol ointment may inhibit the formation of acne scars by regulating TGF-β/Smad signaling pathway.

〔Keywords〕 acne scar; hypertrophic scar; TGF-β/Smad signaling pathway; pomegranate peel polyphenol

痤瘡（Acne）是一種常見的涉及毛囊皮脂腺的慢性炎癥性皮膚病[1]。好發(fā)于青春期男女，其臨床表現(xiàn)包括粉刺、炎性丘疹、膿皰、結(jié)節(jié)和囊腫。約95%的痤瘡患者會(huì)出現(xiàn)不同程度的痤瘡瘢痕，給患者造成嚴(yán)重的心理負(fù)擔(dān)，從而影響其生活質(zhì)量[2-3]。痤瘡瘢痕屬于病理性瘢痕，可表現(xiàn)為萎縮性瘢痕、增生性瘢痕（hypertrophic scar， HS）和瘢痕疙瘩（ke-loid， K）[4]。有研究證實(shí)，TGF-β/Smad通路在增生性瘢痕的形成過程中具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)以增生性痤瘡瘢痕為主要研究對(duì)象，因現(xiàn)階段尚未有明確的痤瘡瘢痕造模方法，故選擇大鼠背部燙傷模型為代表進(jìn)行研究。

石榴皮多酚是石榴皮的主要有效成分，具有抗氧化、抑菌、降脂、抗炎、抗過敏、促進(jìn)皮膚愈合等多重作用[5-7]?；诖?，本研究選用不同濃度的石榴皮多酚軟膏，作用于大鼠背部燙傷后增生性瘢痕，通過蘇木精—伊紅（HE）染色觀察其對(duì)增生性瘢痕的治療作用，用免疫組化檢測TGF-β1、Smad4表達(dá)，從而進(jìn)一步探究石榴皮多酚軟膏抗痤瘡瘢痕形成的作用與TGF-β所介導(dǎo)的Smad通路之間的關(guān)系。

1 材料

1.1 ?動(dòng)物

雄性SD大鼠（清潔級(jí)）36只（批號(hào)：SCXK（湘）2016-0002），體質(zhì)量190～220 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。每只分籠圈養(yǎng)于動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室。飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，濕度50%～70%，光照/黑暗為12 h/12 h條件下飼養(yǎng)，自由飲食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 ?主要藥物與試劑

70%石榴皮多酚提取物（批號(hào)：RY151119，西安瑞盈生物科技有限公司）;自制超高、高、中、低濃度石榴皮多酚軟膏：按處方分別稱取甘油10 g、十八醇5 g、液體石蠟3 g、十二烷基硫酸鈉0.3 g、白凡士林4.5 g、硬脂酸2.5～3.5 g、單硬脂酸甘油酯5 g、月桂氮酮1.2～1.8 g、蒸餾水適量，總量至100 g。其中十八醇、液體石蠟、白凡士林、硬脂酸、單硬脂酸甘油酯作為油相，其余藥品作為水相。然后，將水油兩相分別混合并用恒溫水浴箱加熱至75 ℃，緩慢攪拌均勻至熔融。最后，在75 ℃水浴箱中，將水相以細(xì)流狀緩慢加入油相中，持續(xù)攪拌10 min，常溫下持續(xù)攪拌直至冷凝，得到水包油（O/W）型軟膏基質(zhì)。10%水合氯醛（分析純，上海山浦化工有限公司）;75%乙醇、0.9%氯化鈉注射液、4%多聚甲醛（均產(chǎn)自谷歌生物（長沙）生物科技有限公司）。TGF-β試劑盒（批次：BA0290，100 ？滋L，博士德生物工程有限公司），SMAD4試劑盒（批次：bs-0585R，100 ？滋L，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

1.3 ?主要儀器

FA1004電子分析天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）;RM2235輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)（徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司）;YD-A生物組織攤片機(jī)（金迪生物科技集團(tuán)）;BCD-226SKA冰箱（青島海爾股份有限公司）;DNP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;Motic BA410研究型顯微鏡、Motic 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)[麥克奧迪（廈門）醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司]。

2 方法

2.1 ?造模

首先制作動(dòng)物固定板，20 cm×20 cm×1 cm的木板1塊。為排除激素水平對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，故隨機(jī)選擇雄性SD大鼠36只，飼養(yǎng)1周后，稱質(zhì)量，電動(dòng)剃毛刀脫毛后，用75%酒精將背部2.0 cm×2.0 cm預(yù)定區(qū)域消毒，然后腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）進(jìn)行麻醉，后以俯臥位將麻醉后的大鼠擺放在固定板上，恒溫水浴箱溫度調(diào)設(shè)為85 ℃，將4層無菌紗布置于水浴箱內(nèi)，充分浸泡10 s后取出，均勻覆蓋在大鼠背部裸露區(qū)15 s。再用生理鹽水沖洗，水分用無菌紗布吸干，形成Ⅱ度燙傷模型（病理切片證實(shí)）[8]。

2.2 ?分組與給藥

36只動(dòng)物隨機(jī)分為6組，每組6只：A.模型組（燙傷模型組）;B.陰性對(duì)照組（基質(zhì)軟膏組）;C.石榴皮軟膏低劑量組（低劑量石榴皮多酚+模型組）;D.石榴皮軟膏中劑量組（中劑量石榴皮多酚+模型組）;E.石榴皮軟膏高劑量組（高劑量石榴皮多酚+模型組）;F.石榴皮軟膏超高劑量組（超高劑量石榴皮多酚+模型組）。模型組給予生理鹽水濕敷，陰性對(duì)照組涂1 mL基質(zhì)軟膏，實(shí)驗(yàn)組按照超高、高、中、低劑量組每日分別給予自制1 mL的10%、2.4%、1.6%、0.9%石榴皮多酚軟膏。

2.3 ?觀察指標(biāo)及檢測方法

燙傷程度的判定常依照病檢的組織學(xué)改變作為劃分的標(biāo)準(zhǔn)，與臨床的“三度四分法”基本一致，詳見表1[8]。結(jié)合皮損表現(xiàn)及病檢結(jié)果可對(duì)創(chuàng)面愈合及瘢痕形成情況做出基本判斷，而免疫組化學(xué)檢測則能更進(jìn)一步表達(dá)出各因子在其中發(fā)揮的作用。（1）肉眼觀察：自造模之日起，每日觀察創(chuàng)面，記錄其顏色、有無腫脹、出血、潰爛、結(jié)痂、脫痂等現(xiàn)象，記錄創(chuàng)面修復(fù)的變化情況。（2）病理組織學(xué)檢測：第7、14、21天，腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，剪取創(chuàng)面及其周圍皮膚，部分甲醛固定，石蠟包埋，留作病理檢測，觀察創(chuàng)面的修復(fù)情況，判斷石榴皮多酚軟膏能否促進(jìn)創(chuàng)面愈合及抑制瘢痕形成。（3）免疫組化檢測：TGF-β1、Smad4免疫組織化檢測結(jié)果在20倍放大下隨機(jī)選5個(gè)測定區(qū)域，按一定域值分割陽性細(xì)胞，測定組織中TGF-β1、Smad4表達(dá)的平均積分光密度。

2.4 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均用“x±s”表示，各組間不同時(shí)點(diǎn)TGF-β1、Smad4比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步采用LSD法對(duì)各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)進(jìn)行兩兩比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)均為P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ?肉眼觀察

燙傷后各組大鼠創(chuàng)面皮膚蒼白，燙傷區(qū)域邊界清晰整齊，第1～3天，創(chuàng)面水腫;第4天燙傷區(qū)域可見瘀血、潰瘍，并開始逐漸結(jié)痂。第7天各組燙傷區(qū)域皮膚的厚度加深、硬度加重，肉眼見可呈黃褐色。第14天石榴皮多酚軟膏各組痂皮全部脫落，新生肉芽組織明顯，創(chuàng)面明顯小于模型組和陰性對(duì)照組，而中劑量組較其他劑量組稍明顯;模型組和陰性對(duì)照組仍有較多痂皮尚未脫落，可見少許新生肉芽組織。第21天各組創(chuàng)面大部分已有上皮覆蓋，但仍有部分尚未愈合，已愈合部位有少量毛發(fā)長出，未愈合部位形狀不規(guī)則，肉眼可見中心有鮮紅肉芽組織，其中，石榴皮多酚各組愈合程度較模型組和陰性對(duì)照組高，中劑量組愈合程度較其他劑量組高，其余各組未見明顯差異。

3.2 ?病理組織學(xué)檢測

根據(jù)不同時(shí)點(diǎn)各組HE染色，模型組及陰性對(duì)照組瘢痕可見明顯的真皮層增厚、血管生成和炎細(xì)胞浸潤，而石榴皮多酚軟膏各組，尤其是中劑量組，瘢痕組織增生層明顯比模型組薄，且未見豐富的血管和炎細(xì)胞，其中第14天時(shí)各組HE染色如圖1所示示，模型組和陰性對(duì)照組的表皮壞死層未明顯脫落，顯微鏡下可見大量毛細(xì)血管和少量膠原纖維，石榴皮多酚軟膏組表面大多數(shù)壞死層已經(jīng)脫落，其下的結(jié)締組織新生，有豐富的毛細(xì)血管，可見大量成纖維細(xì)胞及少量新生皮膚附屬器。

3.3 ?免疫組化檢測各組TGF-β1、Smad4表達(dá)情況

各組TGF-β1、Smad4不同時(shí)點(diǎn)表達(dá)的積分光密度比較結(jié)果見表2。各組間第7、14、21天時(shí)TGF-β1、Smad4經(jīng)單因素方差分析結(jié)果顯示，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步采用LSD法對(duì)各組間TGF-β1、Smad4指標(biāo)進(jìn)行兩兩比較結(jié)果顯示：第14、21天時(shí)中劑量組的TGF-β1均明顯低于模型組、陰性對(duì)照組、低劑量組、高劑量組和超高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。第14、21天時(shí)中劑量組的Smad4均明顯低于模型組、陰性對(duì)照組、低劑量組、高劑量組和超高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

4 討論

痤瘡形成的瘢痕主要有3種：一是痤瘡愈合后遺留的表淺性萎縮性瘢痕，二是痤瘡發(fā)生較大面積的嚴(yán)重感染會(huì)產(chǎn)生增生性瘢痕，三是痤瘡在皮下組織較少部位產(chǎn)生的瘢痕疙瘩[9]。增生性痤瘡瘢痕作為痤瘡瘢痕的主要類型，有代表性，具有研究價(jià)值。增生性痤瘡瘢痕同屬于增生性瘢痕，增生性瘢痕是皮膚損傷后由于過度修復(fù)而導(dǎo)致的一種病理性瘢痕，TGF-β被認(rèn)為是促進(jìn)纖維化類疾病發(fā)生必不可少而強(qiáng)有效的細(xì)胞因子，其介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)主要經(jīng)TGF-β/Smad通路傳遞完成對(duì)細(xì)胞核內(nèi)靶基因的調(diào)控，導(dǎo)致成肌纖維細(xì)胞發(fā)生，細(xì)胞外基質(zhì)沉積[10]。江宇峰等[11]證實(shí)在兔耳增生性瘢痕組織中，TGF-β1、Smad4蛋白水平較正常皮膚組織中含量顯著增加，具有重要代表意義，提示增生性瘢痕的形成與 TGF-β/Smad信號(hào)通路異常傳導(dǎo)有關(guān)。

因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)石榴皮多酚軟膏抗增生性痤瘡瘢痕進(jìn)行探究。病理組織學(xué)提示，石榴皮多酚軟膏組較模型組及陰性對(duì)照組創(chuàng)面表皮壞死層脫落早，新生上皮形成較快，直至第21天，結(jié)締組織增生，成纖維細(xì)胞及毛細(xì)血管數(shù)量下降明顯。模型組與陰性對(duì)照組無論在創(chuàng)面修復(fù)速度，還是結(jié)締組織增生情況方面都沒有明顯差異，進(jìn)一步說明，石榴皮多酚軟膏可以加快組織修復(fù)，抑制瘢痕形成。免疫組化學(xué)檢測結(jié)果顯示，石榴皮多酚軟膏可顯著降低增生性瘢痕組織中TGF-β1、Smad4水平，提示石榴皮多酚軟膏抗增生性瘢痕形成作用可能與TGF-β調(diào)控的Smad4表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，石榴皮多酚軟膏可以通過調(diào)控TGF-β/Smad信號(hào)通路抗增生性瘢痕的形成，其中，石榴皮多酚中劑量組效果最佳，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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