陳斌 彭杰 張濤 朱文芳 張茜茜 丁秀麗 黎運芳

〔摘要〕 目的 研究清溫并用法對慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure， ACLF）大鼠結(jié)腸組織Treg/Th17相關(guān)型細(xì)胞因子表達(dá)的影響，探討其抗ACLF腸源性內(nèi)毒素血癥（intestinal endotoxemia， IETM）的可能調(diào)控機(jī)制。方法 140只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、清法組、溫法組及清溫并用法組。牛血清白蛋白致敏法建立免疫性肝纖維化大鼠模型，腹腔注射D-氨基半乳糖+脂多糖急性攻擊建立ACLF大鼠模型，各組予以相應(yīng)干預(yù)，觀察24 h內(nèi)各組大鼠外周血內(nèi)毒素、外周血Treg/Th17細(xì)胞比值、結(jié)腸組織Treg/Th17型細(xì)胞因子變化。結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠在各時間點內(nèi)毒素明顯升高（P<0.01）、Treg/Th17型細(xì)胞因子明顯升高（P<0.01）、Treg/Th17比值明顯降低（P<0.01）;與模型組比較，清法、溫法、清溫并用法組在1、12、24 h各個時間點內(nèi)毒素、Treg/Th17相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)均降低（P<0.05），以清溫并用法組下降最顯著（分別與清法組、溫法組比較，P<0.05）;各組與模型組比較，僅清溫并用法組Treg/Th17比值明顯升高（P<0.05）。結(jié)論 清溫并用法抗肝衰竭IETM的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)結(jié)腸組織Treg/Th17型細(xì)胞因子失衡，促使Treg/Th17細(xì)胞恢復(fù)平衡有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 清溫并用法;慢加急性肝衰竭;Treg/Th17型細(xì)胞因子

〔中圖分類號〕R285.5;R575.4 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.05.003

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of clearing and warming simultaneously on the expression of Treg/Th17 associated cytokines in colon tissue of rats with acute and chronic liver failure （ACLF）， and to explore its possible regulation mechanism of ACLF against intestinal endotoxemia （IETM）. Methods A total of 140 SD rats were randomly divided into a normal group， a model group， a clearing group， a warming group， and a clearing and warming simultaneously group. The rats model of immune hepatic fibrosis were established by sensitization with bovine serum albumin， and then ACLF rats were induced by intraperitoneal injection of D-galactose and lipopolysaccharide （LPS）. The changes of endotoxin in peripheral blood， ratio of Treg/Th17 cells in peripheral blood and Treg/Th17 cytokines in colonic tissue were observed within 24 hours. Results Compared with the normal group， the toxins in the model group were significantly increased at each time point （P<0.01）， the Treg/Th17 cytokines were significantly increased （P<0.01）， and the Treg/Th17 ratio was significantly lower （P<0.01）. Compared with the model group， the expression of toxin and Treg/Th17-related cytokines were decreased in the clearing group， the warming group， the clearing and warming simultaneously group at 1 h， 12 h， and 24 h （P<0.05）. The decrease in the clearing and warming simultaneously group was the most significant （compared with the clearing group， the warming group， P<0.05）. Compared with the model group， the ratio of Treg/Th17 was significantly increased in the clearing and warming simultaneously group than in the model group （P<0.05） Conclusion The mechanism of treating acute-on-chronic liver failure IETM in using clearing and warming simultaneously is related to the regulation of Treg/Th17 cytokine in colonic tissue and promoting the balance of Treg/Th17 cells

〔Keywords〕 clearing and warming simultaneously; acute-on-chronic liver failure; Treg/Th17 cytokines

慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure， ACLF）是在慢性肝病基礎(chǔ)上出現(xiàn)的急性肝功能失代償[1]，其中、后期病理機(jī)制以腸源性內(nèi)毒素血癥（intestinal endotoxemia， IETM）為主，發(fā)生率高達(dá)93.3%～100%[2]，是引起肝衰竭患者病情惡化和死亡的重要原因。近年來，Treg/Th17細(xì)胞成為炎癥反應(yīng)調(diào)控研究的熱點[3]，研究顯示肝衰竭患者Treg/Th17細(xì)胞頻數(shù)及相關(guān)細(xì)胞因子水平明顯升高，表明終末期肝病中存在Treg/Th17細(xì)胞比例及其炎癥因子失衡，且對病情的進(jìn)展發(fā)揮重要作用[4]。課題組長期臨床實踐及前期研究證實清溫并用法對肝衰竭腸源性內(nèi)毒素血癥有效[5-6]。本實驗以Treg/Th17細(xì)胞比值及相關(guān)細(xì)胞因子為主要研究指標(biāo)，探討清溫并用法減輕慢加急性肝衰竭IETM炎癥反應(yīng)的可能免疫學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 ?動物

140只健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量（140±15） g，所有大鼠皆從湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司購得，許可證號：SCXK（湘）2016-0002。

1.2 ?藥物與試劑

中藥茵陳蒿湯（方中茵陳30 g，梔子10 g，大黃10 g，甘草6 g）;茵陳術(shù)附湯（方中茵陳30 g，白術(shù)15 g，附子10 g，肉桂3 g，干姜5 g，甘草6 g）;溫陽解毒化瘀（方中丹參30 g，赤芍60 g，白術(shù)30 g，茵陳30 g，薏苡仁30 g，附片10 g）。所有中藥飲片均購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房（每一付中藥都采用傳統(tǒng)煎藥方法，煎取400 mL藥液，再用恒溫水浴鍋將其濃縮成100 mL，3個方劑中的生藥含量分別為0.65 g/mL、0.69 g/mL、1.90 g/mL。牛血清白蛋白（Solarbio公司，批號：630G056/518H052），氨基半乳糖、弗氏不完全佐劑、脂多糖（Sigma公司，批號分別為： 210E052、1002453350、426H032），細(xì)菌內(nèi)毒素試劑盒（湛江博康海洋生物，批號：17051004），IL-10、TNF-α、IL-17、IL-23 A、TGF-β ELISA KIT（上海晶天生物，批號分別為1710022、1710025、1710008、1710013、1710027）。

1.3 ?儀器

DHP-9052恒溫箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）;微量移液槍（Rainin PiPet-Lite美國）;離心機(jī)（德國Eppendorf，Centrifuge 5424 R）;超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝技術(shù)公司，JY92-Ⅱ型）;超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司，SW-CJ-2D型）;電子天平（上海臺之橫電子衡器有限公司，F(xiàn)A型）;流式細(xì)胞儀（Becton， Dickinson and Company）;MTP-601F自動熒光酶標(biāo)儀（日本日立公司）。

1.4 ?動物造模

采用牛血清白蛋白致敏法造模，建立免疫性肝纖維化大鼠模型[7-8]，每次取含牛血清白蛋白4 mg牛血清白蛋白乳化液0.5 mL進(jìn)行皮下多點注射致敏，前后分別間隔時間為14、10、10 d，總共注射4 次;再通過2 次/周的尾靜脈注射牛血清白蛋白，劑量自2 mg/次依次遞加0.5 mg/次，最后以4 mg/次劑量維持，全程共6周;第6周末，除正常組外，其余各組通過一次性腹腔注射D-Gal+LPS液（D-Gal 400 mg/kg，LPS 100 μg/kg）急性攻擊建立肝衰竭IETM大鼠模型。急性攻擊后，分別于1、12、24 h處死動物，采集大鼠外周血門靜脈血及結(jié)腸組織樣本。

1.5 ?分組與干預(yù)

將140只SD大鼠室內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分出正常組大鼠10只（蒸餾水），剩下130只大鼠建立免疫性肝纖維化大鼠模型，造模完成81只，隨機(jī)將這81只大鼠分為模型組（蒸餾水）、清法組（茵陳蒿湯）、溫法組（茵陳術(shù)附湯）各20只，清溫并用法組（溫陽解毒化瘀方）21只。藥物用量參考文獻(xiàn)[9]，以大鼠與人的給藥劑量系數(shù)6.17計算，得出清法組、溫法組、清溫并用法組生藥灌胃量分別為5.759 g/kg、7.096 g/kg、19.538 g/kg。在造模過程的第6周開始進(jìn)行中藥灌胃干預(yù)，每日1次，一直干預(yù)至急性攻擊前，共1周。在腹腔急性攻擊之后，每隔6小時灌胃1次，用同等容量的蒸餾水對正常組和模型組進(jìn)行灌胃。

1.6 ?觀察指標(biāo)

1.6.1 ?內(nèi)毒素檢測 ?采集大鼠門靜脈血樣1 mL加入體液處理劑Ⅰ號試管內(nèi)，封閉試管口后混勻15 s，以3 200 r/min速度離心6 min，得到1.6倍上清液;取制得的1.6倍上清液0.4 mL加入體液處理劑Ⅱ號試管內(nèi)混勻，置于水浴箱加熱6 min，混勻后以4 200 r/min速度離心6 min，得到4倍上清液;取其0.3 mL加入檢查用水試管中混勻，得到8倍液以備用;取出鱟試劑，分別進(jìn)行檢查用水、供試品溶液、質(zhì)控品溶液加樣;按試劑盒要求測試。

1.6.2 ?結(jié)腸組織IL-10、TNF-α、TGF-β、IL-23、IL-17A檢測 ?參照ELISA試劑盒說明書操作：取40 μL樣本加入待測樣品孔，后分別加入50 μL鏈酶親和素-HRP和10 μL需檢測抗體，蓋上封板膜，混勻，37 ℃恒溫箱溫育60 min;用蒸餾水稀釋30倍濃縮洗滌液后備用;揭開封板膜后去掉液體甩干后于每個孔加滿稀釋后的洗滌液，靜置30 s后去掉洗滌液，重復(fù)5次操作后拍干;顯色：每個孔中先后加入顯色劑A 50 μL和顯色劑B 50 μL，搖勻后在 37 ℃條件下避光顯色10 min;每孔加50 μL終止液終止反應(yīng)，10 min內(nèi)測定各孔的OD值。

1.6.3 ?外周血Treg/Th17細(xì)胞頻數(shù)表達(dá)檢測 ?采集大鼠外周血2 mL，加入10 μL的CD4抗體，室溫避光孵育20 min;400 r/min速度離心5 min后去掉上清液，再加入2 mL的PBS，混勻，離心，去掉上清液;加入100 μL的IC Fixation buffer，室溫避光孵育40 min，加2 mL的1×Permeabilization buffer，離心，去掉上清液;加入IL-17A抗體5 μL，混勻，室溫避光孵育40 min;加300 μL PBS混勻避光存放，按照流式細(xì)胞分析試劑盒說明書要求和標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程操作檢測。Treg細(xì)胞檢測使用CD4和FOXP3抗體標(biāo)記，實驗步驟同上。

1.7 ?統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用PSPP17.0進(jìn)行統(tǒng)計分析處理，計量資料用“x±s”表示，釆用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進(jìn)行多組間比較，進(jìn)一步兩兩比較選用LSD-t法檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ?一般情況觀察

除正常組外余130 只大鼠在牛血清白蛋白皮下多點注射致敏階段無死亡，尾靜脈注射攻擊開始到第5周末共死亡39只，成模91只，腹腔注射D-Gal+LPS進(jìn)行急性攻擊后，大鼠出現(xiàn)精神萎靡，活動遲緩，部分出現(xiàn)肢體扭曲等衰弱貌;正常組大鼠無死亡，飲食量正常、活動靈敏，無行為異常;模型組1 h死亡1只，死亡率5%，12 h共死亡3 只，死亡率15%，24 h共死亡5只，死亡率25%;清法組、溫法組在1 h死亡率0%，12 h死亡1只，死亡率5%，至24 h共死亡2 只，死亡率10%;清溫并用法組各時間點無死亡。

2.2 ?各組大鼠門靜脈血內(nèi)毒素含量比較

與正常組比較，模型組內(nèi)毒素水平在1、12、24 h時間點均升高（P<0.01）;與模型組比較，清法組、溫法組、清溫并用法組內(nèi)毒素水平在1、12、24 h各時間點均降低（P<0.05），以清溫并用法組降低最顯著（分別與清法組、溫法組比較，P<0.05）;清法組與溫法組之間內(nèi)毒素水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

2.3 ?各組大鼠外周血Treg/Th17細(xì)胞比值比較

與正常組比較，模型組Treg/Th17細(xì)胞頻數(shù)表達(dá)在1、12、24 h時間點皆顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，清法組、溫法組Treg/Th17細(xì)胞比值無明顯升高（P>0.05），清溫并用法組Treg/Th17比值在以上各時間點均明顯升高（P<0.05），具體結(jié)果參見文獻(xiàn)[10]。

2.4 ?各組大鼠結(jié)腸組織Th17型細(xì)胞因子IL-17A、IL-23、TNF-α表達(dá)

與正常組比較，模型組Th17細(xì)胞相關(guān)因子IL-17A、IL-23、TNF-α在各時間點表達(dá)均升高（P<0.01）;與模型組比較，清法組、溫法組、清溫并用法組IL-17A、IL-23、TNF-α水平降低（P<0.05），以清溫并用法組降低最顯著（分別與清法、溫法組比較P<0.05）。見表2。

2.5 ?各組大鼠結(jié)腸組織Treg型細(xì)胞因子TGF-β、IL-10表達(dá)

模型組與正常組比較，Treg細(xì)胞相關(guān)因子TGF-β、IL-10在各時間點表達(dá)均明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，清法組、溫法組、清溫并用法組TGF-β、IL-10各時間點表達(dá)下降（P<0.05），以清溫并用法組降低最明顯（分別與清法、溫法組比較，P<0.05）。見表3。

3 討論

肝衰竭是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)名稱，其病情重，且發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，中醫(yī)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中將其納入于“肝瘟”“瘟黃”“急黃”等范疇，臨床上一般從陰黃陽黃辨證論治，但課題組在長期臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，肝衰竭患者在中晚期常易出現(xiàn)IETM，此時，黃疸中醫(yī)證候?qū)W表現(xiàn)既非完全陽黃，又不能用單純陰黃概而論之，而表現(xiàn)出虛實夾雜的證候?qū)W特點，發(fā)病機(jī)制上屬于“瘀（血）、毒（熱）、虛（脾）互結(jié)”[11]，其治療上注重清溫并用，“清”即清熱利濕，“溫”即溫陽健脾，療效得到顯著提高，課題組前期研究中已揭示清溫并用法治療肝衰竭的作用機(jī)制可能與減輕腸源性內(nèi)毒素血癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[5-6]，其調(diào)控機(jī)制目前尚不明確。而局部炎癥反應(yīng)作為ACLF內(nèi)毒素血癥病理生理的核心環(huán)節(jié)，其發(fā)病過程中抑炎與促炎作用失衡導(dǎo)致“炎癥反應(yīng)失控”，機(jī)體免疫應(yīng)答紊亂。其中CD4+T細(xì)胞在機(jī)體免疫應(yīng)答以及炎癥反應(yīng)中起到調(diào)節(jié)中心作用，其新的亞群Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞是當(dāng)前炎癥反應(yīng)調(diào)控研究的熱點。相關(guān)研究報道發(fā)現(xiàn)由腸、肝和免疫系統(tǒng)所構(gòu)成的生物軸在ACLF患者IETM的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[12]。

本研究通過研究大鼠結(jié)腸組織Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞分泌效應(yīng)細(xì)胞因子表達(dá)水平及其與IETM之間的內(nèi)在關(guān)系，旨在為探索ACLF發(fā)生IETM的可能免疫學(xué)機(jī)制提供一個全新的角度。從研究結(jié)果分析顯示ACLF腸源性內(nèi)毒素血癥大鼠存在外周血Treg/Th17細(xì)胞失衡，其失衡具體表現(xiàn)為Th17細(xì)胞比例上升，Treg/Th17比值下降，門靜脈內(nèi)毒素水平明顯升高，這一結(jié)果與Zhong Y M等[13]的研究結(jié)果基本相一致，認(rèn)為ACLF在病理狀態(tài)下必然存在導(dǎo)致 Treg/Th17細(xì)胞失衡的有關(guān)因素，外周血Treg/Th17失衡向Th17偏移，是ACLF病情發(fā)展加劇的可能病理機(jī)制。

Treg細(xì)胞作為CD4+T細(xì)胞中具有抑制炎癥反應(yīng)作用的新亞群，主要通過分泌TGF-β、IL-10等細(xì)胞因子來發(fā)揮其抑炎作用;相對應(yīng)的，Th17細(xì)胞作為CD4+T細(xì)胞中具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)作用的新亞群，通過分泌IL-17A、IL-23及TNF-α等細(xì)胞因子發(fā)揮促炎作用[14-15]。正常情況下，二者處于平衡狀態(tài)，一旦兩者免疫平衡失調(diào)，Treg細(xì)胞不足以抑制過度炎癥反應(yīng)，可造成組織炎性反應(yīng)失控，促進(jìn)相關(guān)疾病的病情進(jìn)展加劇[16]。本研究中模型組Treg/Th17細(xì)胞相關(guān)因子均較正常組有上升，但以Th17細(xì)胞相關(guān)的促炎細(xì)胞因子IL-23、IL-17A升高更為顯著，其表達(dá)水平與肝組織損傷炎癥壞死程度保持一致，并且與ACLF的高病死率有密切的相關(guān)性[17-18]。Wang N等[19]研究指出HBV-ACLF 病死患者血漿中的 IL-10等抑炎因子水平也明顯升高，同樣的，本研究在ACLF腸源性內(nèi)毒素血癥大鼠研究中也存在IL-10表達(dá)的上升。由此可以推測ACLF外周血在Treg/Th17細(xì)胞表達(dá)失衡的同時，也導(dǎo)致了其相應(yīng)效應(yīng)細(xì)胞因子表達(dá)水平的嚴(yán)重失衡，進(jìn)而促進(jìn)了ACLF腸源性內(nèi)毒素血癥的發(fā)生發(fā)展，使ACLF的病情進(jìn)一步重癥化。

課題組在大鼠造模成功后分別予以清法、溫法、清溫并用法代表方劑進(jìn)行治療干預(yù)，研究結(jié)果顯示3種治療方法都能夠使Treg/Th17細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平降低，其中Th17細(xì)胞相關(guān)因子TNF-α、IL-17A、IL-23下降趨勢比Treg細(xì)胞相關(guān)因子TGF-β、IL-10的下降趨勢更明顯，從而促進(jìn)了Treg/Th17細(xì)胞失衡的恢復(fù)，門靜脈內(nèi)毒素水平也下降;同時，研究發(fā)現(xiàn)清溫并用法的效果要明顯優(yōu)于清法和溫法，且促使Treg/Th17細(xì)胞比值升高明顯的只有經(jīng)清溫并用法干預(yù)的大鼠，其門靜脈內(nèi)毒素表達(dá)水平在3種干預(yù)方案中最低。因此，可以推斷，清溫并用法能同時抑制慢加急性肝衰竭IETM時Treg、Th17細(xì)胞相關(guān)效應(yīng)細(xì)胞因子的分泌產(chǎn)生，抑制相關(guān)促炎與抑炎因子釋放，并促進(jìn)Treg/Th17細(xì)胞比值恢復(fù)，使免疫調(diào)節(jié)趨于平衡，從而發(fā)揮減輕慢加急性肝衰竭發(fā)生IETM炎癥反應(yīng)的作用。

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