王玲， 蔡岳華， 焦榮華， 賀百花， 陽寧

1湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥技術(shù)學(xué)院(湖南衡陽 421001)； 2南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科(湖南衡陽 421001)

乳腺癌是一種乳腺上皮組織惡性腫瘤，發(fā)病率高，對女性身心健康危害大?；熓侨橄侔┲委煹闹饕侄危桩a(chǎn)生耐藥性，從而降低藥物的療效，甚至導(dǎo)致治療失敗[1-2]。因此，深入闡明乳腺癌耐藥性的產(chǎn)生機(jī)制，并從中尋找關(guān)鍵性的靶點(diǎn)，對逆轉(zhuǎn)耐藥性及提高臨床療效具有重要的意義。Akt又稱為蛋白激酶B，被磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)激活后，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥性的產(chǎn)生[3-6]。近年研究表明，Akt失調(diào)與乳腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，被認(rèn)為是腫瘤預(yù)后不良的一個(gè)獨(dú)立預(yù)測因子[7-8]。阿霉素(adriamycin, ADM)是乳腺癌化療的常用藥物，但Akt在乳腺癌ADM化療耐藥中的作用尚待研究。2017年6月至2018年5月，本研究首先觀察Akt在人乳腺癌細(xì)胞ADM敏感株(MCF-7/S)和耐藥株(MCF-7/ADM)中的表達(dá)和活性，然后用小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)技術(shù)沉默MCF-7/ADM細(xì)胞中Akt表達(dá)，探討其對ADM耐藥性的影響及分子機(jī)制，從而為抑制乳腺癌細(xì)胞多藥耐藥提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物與主要試劑 MCF-7/S和MCF-7/ADM細(xì)胞由中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院提供，來源于美國國立癌癥研究所。ADM為深圳萬樂藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。新生胎牛血清以及DMEM培養(yǎng)基購于Gibco公司提供。Akt小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)和陰性對照 siRNA由上海吉瑪公司合成。LipofectamineTM2000和PVDF膜購于美國Invitrogen公司。兔抗人Akt、磷酸化Akt(phosphorylated Akt, p-Akt)、Bcl-2、Bax、P-gp及β-actin單克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司。RIPA蛋白裂解液和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供。Annexiv-FITC/碘化丙啶(propidium iodide, PI)雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒由貝博生物提供。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜購自美國 Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7/S、MCF-7/ADM細(xì)胞復(fù)蘇后接種于含10%新生胎牛血清、100 U/mL的青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，靜置于37℃、5%CO2、100%濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天換液1次，待細(xì)胞生長至80%～90%融合度時(shí)，以0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到一定數(shù)量，且呈現(xiàn)對數(shù)生長時(shí)待用。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取上述呈對數(shù)生長的MCF-7/S、MCF-7/ADM細(xì)胞，接種于96孔板中(1×106/孔)，每個(gè)培養(yǎng)孔加入0.18 mL DMEM培養(yǎng)液，孵育24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。分為3組：空白對照組、陰性對照siRNA組和Akt siRNA組，利用lipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒，分別予培養(yǎng)液、陰性對照siRNA(20 nmol/L)、Akt siRNA(20 nmol/L)處理細(xì)胞48 h。Akt siRNA核苷酸序列為 5′-CCUGGGUAA-AAGAAGUCAATT-3′(正義鏈)和5′-UUGACUUCUUUGACCCAGGTT-3′(反義鏈)；陰性對照siRNA核苷酸為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′(正義鏈)和5′-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3′(反義鏈)。

1.4 Western blot 收集處理完畢后的MCF-7/S、MCF-7/ADM細(xì)胞，用RIPA蛋白裂解液提取細(xì)胞中總蛋白質(zhì)，BCA法進(jìn)行蛋白定量，上樣、電泳并轉(zhuǎn)膜，加入兔抗人一抗，其中Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax、P-gp抗體的稀釋濃度為1∶500，β-actin抗體的稀釋濃度為1∶2 500，4℃孵育過夜，洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶2 500)二抗，在37℃條件下孵育1 h，ECL(廣州永諾生物科技有限公司)顯色，暗室曝光。利用Labwork凝膠圖像分析系統(tǒng)對所有膠片進(jìn)行掃描，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)水平。

1.5 MTT比色法檢測MCF-7/S、MCF-7/ADM細(xì)胞對ADM的敏感性 取對數(shù)生長期的MCF-7/S、MCF-7/ADM細(xì)胞，接種于96孔板中(1×106/孔)，分別予培養(yǎng)液、Akt siRNA(20 nmol/L)處理48 h，然后分別加入不同濃度的ADM(0.5、1、2、4、8、16 μmol/L)，培養(yǎng)24 h后每孔加入20 μL MTT溶液(0.5 g/L)，培養(yǎng)4 h，小心吸去培養(yǎng)液，并添加150 μL二甲基亞砜，置入搖床，低速振蕩10 min，以二甲基亞砜調(diào)零，利用Bio-Tek808酶標(biāo)儀(美國 Bio-Rad公司)測定570 nm波長下每孔的吸光度(A)值，據(jù)此計(jì)算ADM的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)和耐藥倍數(shù)，其中耐藥倍數(shù)=MCF-7/ADM細(xì)胞IC50/MCF-7/S細(xì)胞IC50。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測MCF-7/ADM細(xì)胞凋亡 收集MCF-7/ADM細(xì)胞，用PBS洗滌2次，以1 000 r/min離心10 min，棄上清，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106·mL-1，加5 μL Annexiv-FITC至終濃度為1 g/L，37℃避光溫浴30 min，然后加PI至終濃度為5 μg/mL，用350目尼龍網(wǎng)濾膜過濾以去除細(xì)胞團(tuán)塊，4℃避光染色30 min后，上流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)光波長用488 nm，用一波長為515 nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一波長>560 nm的濾器檢測PI?？偟蛲雎?右上象限(Q2)凋亡率+右下象限(Q4)凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 MCF-7/ADM細(xì)胞Akt活性增加 整體Akt水平無明顯變化(P>0.05)，但MCF-7/ADM細(xì)胞p-Akt水平明顯高于MCF-7/S細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖1、表1。

2.2 Akt siRNA轉(zhuǎn)染效率檢測 相對于空白對照組，陰性對照siRNA組Akt水平無變化(P>0.05)，而Akt siRNA組Akt水平顯著降低(P<0.01)。見圖2、3和表2。

2.3 沉默Akt增強(qiáng)MCF-7/ADM細(xì)胞對ADM化療的敏感性 用ADM處理后，MCF-7/S、MCF-7/ADM細(xì)胞的IC50分別為(0.36±0.06)、(3.54±3.27) μmol/L，耐藥倍數(shù)為65.39倍，而Akt siRNA和ADM共處理的MCF-7/S、MCF-7/ADM細(xì)胞，IC50分別為(0.28±0.05)、(2.17±0.29)μmol/L，耐藥倍數(shù)下降至7.75倍。

A: MCF-7/S細(xì)胞; B: MCF-7/ADM細(xì)胞

圖1Westernblot檢測MCF-7/S、MCF-7/ADM細(xì)胞Akt和p-Akt表達(dá)

細(xì)胞Akt表達(dá)p-Akt表達(dá)MCF-7/S細(xì)胞0.86±0.120.32±0.04MCF-7/ADM細(xì)胞0.89±0.13 0.68±0.09?

*與MCF-7/S細(xì)胞比較P<0.01

A: 空白對照組; B: 陰性對照siRNA組; C: Akt siRNA組圖2 Western blot檢測MCF-7/S細(xì)胞Akt表達(dá)

A: 空白對照組; B: 陰性對照siRNA組; C: Akt siRNA組

圖3Westernblot檢測MCF-7/ADM細(xì)胞Akt表達(dá)

表2 各組MCF-7/S、MCF-7/ADM細(xì)胞Akt表達(dá)水平比較

*與空白對照組比較P<0.01

2.4 沉默Akt 促進(jìn)MCF-7/ADM細(xì)胞凋亡 Akt siRNA組凋亡率較空白對照組增加(P<0.01)，而陰性對照siRNA組凋亡率與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4、表3。

2.5 沉默Akt對MCF-7/ADM細(xì)胞Bcl-2、Bax表達(dá)的影響 Akt siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7/ADM細(xì)胞下調(diào)Bcl-2表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)，與空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染不影響MCF-7/ADM細(xì)胞Bcl-2、Bax的表達(dá)(P>0.05)。見圖5、表3。

A: 空白對照組; B: 陰性對照siRNA組; C: Akt siRNA組圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測MCF-7/ADM細(xì)胞凋亡

2.6 沉默Akt抑制MCF-7/ADM細(xì)胞P-gp表達(dá) Western blot結(jié)果表明，Akt siRNA組MCF-7/ADM細(xì)胞P-gp表達(dá)水平較空白對照組降低(P<0.01)，然而陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染對P-gp表達(dá)水平無影響(P>0.05)。見圖6、表3。

組別凋亡率(%)Bcl-2表達(dá)Bax表達(dá)P-gp表達(dá)空白對照組16.28±3.140.76±0.150.27±0.04 0.84±0.19陰性對照siRNA組17.59±3.670.73±0.140.31±0.05 0.81±0.17Akt siRNA組 38.46±6.28? 0.38±0.07? 0.62±0.11?0.43±0.09?

*與空白對照組比較P<0.01

A: 空白對照組; B: 陰性對照siRNA組; C: Akt siRNA組圖5 Western blot檢測MCF-7/ADM細(xì)胞Bcl-2和Bax表達(dá)

A: 空白對照組; B: 陰性對照siRNA組; C: Akt siRNA組圖6 Western blot檢測MCF-7/ADM細(xì)胞P-gp表達(dá)

3 討論

Akt是存在于人類染色體中的鼠類胸腺瘤病毒致癌基因的同源物，是一種癌基因，包含AH/PH結(jié)構(gòu)域、催化結(jié)構(gòu)域和尾部的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。PI3K通過磷酸化Akt促進(jìn)其激活，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、自噬等生物學(xué)過程，并與腫瘤細(xì)胞獲得性耐藥的出現(xiàn)密切相關(guān)[9-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，MCF-7/ADM細(xì)胞p-Akt水平明顯高于MCF-7/S細(xì)胞，提示Akt在耐藥的乳腺癌細(xì)胞中呈活化狀，而且用siRNA沉默Akt表達(dá)后，MCF-7/ADM細(xì)胞對ADM化療敏感性明顯增加，這些結(jié)果表明抑制Akt可能是減少乳腺癌耐藥性的一個(gè)有價(jià)值的途徑。

細(xì)胞凋亡即Ⅰ型程序性細(xì)胞死亡，指在多種基因調(diào)控下發(fā)生的細(xì)胞主動死亡過程，其中Bcl-2抑制凋亡過程，而Bax促進(jìn)凋亡發(fā)生[13]。細(xì)胞凋亡不足是腫瘤化療耐藥性產(chǎn)生的一個(gè)重要原因。PI3K/Akt信號通路在調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[14-18]。Hu等[19]報(bào)道，姜黃素通過抑制Akt磷酸化促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡。蟾毒靈是中藥蟾酥的活性成分之一，有廣譜抗癌作用。研究發(fā)現(xiàn)，蟾毒靈通過抑制PI3K/Akt信號通路，使乳腺癌細(xì)胞凋亡率增加[20]。本研究中，Akt siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7/ADM細(xì)胞促進(jìn)凋亡發(fā)生，并下調(diào)Bcl-2表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)。因此，沉默Akt通過降低Bcl-2/Bax比值誘導(dǎo)MCF-7/ADM細(xì)胞凋亡，這可能是其減少乳腺癌耐藥性的一個(gè)重要機(jī)制。

P-gp是一個(gè)170 kD的跨膜糖蛋白，具有ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能，可將腫瘤細(xì)胞內(nèi)的化療藥物泵出細(xì)胞，從而降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，產(chǎn)生耐藥性[21-22]。已有研究表明，P-gp在40%的乳腺癌組織中呈高表達(dá)，提示P-gp過表達(dá)是引起乳腺癌患者發(fā)生多藥耐藥的重要原因[23]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，華蟾素通過下調(diào)MCF-7/ADM細(xì)胞P-gp表達(dá)，使細(xì)胞內(nèi)ADM濃度升高，從而增強(qiáng)耐藥腫瘤細(xì)胞對ADM的敏感性[24]。P-gp是PI3K/Akt信號通路的下游效應(yīng)子。林思園等[25]用LY294002阻斷PI3K/Akt信號通路，發(fā)現(xiàn)P-gp表達(dá)下調(diào)，MCF-7/ADM細(xì)胞對ADM敏感性明顯增加。本研究中，Akt siRNA組MCF-7/ADM細(xì)胞P-gp表達(dá)水平顯著低于空白對照組，提示抑制P-gp表達(dá)也是Akt沉默減少M(fèi)CF-7/ADM細(xì)胞耐藥性的重要原因。

綜上所述，沉默Akt可能通過促進(jìn)凋亡和下調(diào)P-gp表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADM細(xì)胞對ADM的耐藥性。因此，抑制PI3K/Akt信號通路有望成為拮抗乳腺癌細(xì)胞多藥耐藥及提高化療效果的新策略。