戎曉東， 陳炫光， 蔡維洵， 陳國章

中山大學腫瘤防治中心、華南腫瘤學國家重點實驗室放療科(廣東廣州 510630)

原發(fā)性肝細胞癌(hepatocelluar carcinoma)簡稱肝癌,是我國常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位于我國惡性腫瘤發(fā)病率的第3位，病死率位于我國腫瘤相關死亡率的第2位[1-2]。世界范圍內(nèi)每年約有70萬新發(fā)肝癌病例，其中我國占世界肝癌發(fā)病人數(shù)一半左右，近年來肝癌發(fā)病率更是有逐漸升高的趨勢。肝癌具有起病隱匿、惡性程度高、進展迅速的特點，早期常無明顯癥狀，導致約80%肝癌患者被確診時已處于中晚期，從而喪失了手術機會[1-2]。由此可見，肝癌嚴重威脅我國人民健康和生命。近年來，隨著放射治療技術的發(fā)展，立體定向放療已經(jīng)被證明在可手術或不可手術切除的肝癌患者中效果良好，可極大提高肝癌患者預后[3-6]。但在臨床實踐中有些肝癌患者存在著對射線并不敏感的現(xiàn)象，導致放療效果不佳[7-10]。然而，關于導致肝癌細胞放射抵抗的機制研究較少，因此，進一步研究肝癌細胞放射抵抗的作用機制，靶定關鍵分子，具有重要的臨床意義。SNHG11，屬于長鏈非編碼RNA，定位于染色質(zhì)20q11.23，目前其功能尚不明確，2018年1月至2019年2月，我們通過分析SNHG11對肝癌細胞放療抵抗的生物學作用及對γH2AX表達水平的影響，為深入了解肝癌細胞放射治療抵抗提供更多理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞 肝癌細胞株SK-Hep1和SMMC-7721均購自中科院上海細胞庫。

1.2 主要試劑 c-caspase3一抗、總caspase3一抗、γH2AX一抗均購自美國Cell Signalling Technology(CST)公司，GAPDH一抗、β-actin一抗、HSP70一抗均購自北京銳抗，兔二抗、鼠二抗購自中山金橋；DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco。

1.3 細胞培養(yǎng) SK-Hep1細胞使用含有10%南美胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，SMMC-7721細胞使用含有10%南美胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.4 慢病毒表達載體的構建及感染 計算感染病毒體積=(MOI×細胞數(shù)量)÷病毒滴度，將SK-Hep1細胞以每孔5×105個細胞接種到6孔板中培養(yǎng)，待細胞貼壁24 h后，1 mL細胞培養(yǎng)基中加入適量sh-con和sh-SNHG11慢病毒懸液，加至6孔板中培養(yǎng)8～10 h，再加入1 mL細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3 d。按照同樣的方法向SMMC-7721細胞中轉染Control和SNHG11的慢病毒，提取細胞總RNA，用qRT-PCR檢測細胞中SNHG11的表達水平，建立穩(wěn)定過表達和敲低SNHG11的細胞株模型。

1.5 RNA提取 將轉染了敲低或過表達SNHG11慢病毒48 h的SK-Hep1和SMMC-7721細胞株接種至6 cm皿中，即SNHG11、Control、sh-SNHG11、sh-con共4組，待細胞長至80%可進行RNA的提取。培養(yǎng)好的細胞去除培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌2遍，加入1 mL總RNA提取試劑Trizol(購自Invitrogen公司)，用移液槍反復吹吸以充分裂解細胞。待裂解液由黏稠變?yōu)榍逑『髮⒁后w吸入1.5 mL離心管中，冰上靜置5 min。向離心管中加入200 μL氯仿，劇烈振蕩后離心15 min，液體分為3層，將含有RNA的上層水相到新的1.5 mL去酶離心管中，加入0.5 mL異丙醇，上下顛倒，充分混勻，離心10 min，去除上清，用75%乙醇(DEPC水配置)洗滌沉淀，去除上清后晾干，用DEPC水溶解RNA沉淀并測量濃度。

1.6 實時定量PCR RNA逆轉錄按PrimeScirpt逆轉錄試劑盒(TaKaRa)說明書操作，定量PCR用SYBR Green PCR Mater Mix，定量PCR儀為Roche lightCycler 4800。逆轉錄反應條件為37℃孵育60 min，85℃孵育5 min終止反應。PCR反應條件為95℃10 min預變性，95℃10 s變性，60℃退火20 s，72℃延伸10 s，共40個循環(huán)。檢測完成后，計算機系統(tǒng)自動分析個樣本Ct值，采用2-ΔΔCt計算基因的相對表達量。使用的引物序列如下：SNHG11-F：5′-GGTGCTGTGTACCTCCTCC-3′，SNHG11-R：5′-CAGATCAGGGTGCTGCAGG-3′。

1.7 Western blot 將構建好的過表達或敲低SNHG11細胞株接種至6孔板中(分別為SNHG11、Control、sh-SNHG11、sh-con 4組)，待細胞貼壁以后進行4 Gy照射，每組均收取未照射及照射后2、4、6 h的蛋白，進行Western blot。首先用胰酶消化收集細胞，用PBS緩沖液洗滌3遍，加入適量RIPA裂解液裂解蛋白，振蕩、離心，去除沉淀，取上清，用BCA試劑盒測定蛋白濃度，加入適量蛋白上樣緩沖液，用沸水煮5～10 min，-80℃保存。蛋白電泳按照等質(zhì)量30 μg上樣，經(jīng)12% SDS-PAGE凝膠電泳后電轉至硝酸纖維素膜上，用含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉1 h，一抗孵育、二抗孵育后，進行ECL法暗室發(fā)光顯像，用Image J軟件測量條帶灰度值并進行統(tǒng)計。

1.8 細胞照射 肝癌細胞放射處理方法為：6 MV X射線進行室溫垂直照射，劑量率為200 cGy/min，照射野為15 cm×15 cm，源皮距為100 cm?？寺⌒纬蓪嶒炚丈浞椒椋瑢β《痉€(wěn)定表達的細胞進行放射，所使用劑量為0、2、4、6、8 Gy。Western blot檢測蛋白表達水平使用的劑量為4 Gy。

1.9 克隆形成實驗 將Control和過表達SNHG11的SMMC-7721細胞，以及轉染sh-con和sh-SNHG11的SK-Hep1細胞種植到培養(yǎng)板中，在孵箱中培養(yǎng)24 h后進行放射。種植細胞的數(shù)量和照射劑量都為梯度，分別是0 Gy種400個細胞，2 Gy種800個細胞，4 Gy種1 600個細胞，6 Gy種3 200個細胞，8 Gy種6 400個細胞。將照射后的細胞置于37℃，5%CO2的孵箱進行培養(yǎng)，向培基中按照1∶100的比例加入青鏈霉素混合液，每5 d換1次液。連續(xù)培養(yǎng)14 d后去除培基，以PBS緩沖液洗滌細胞2次，用甲醇固定1 h，1%結晶紫染色1 h，清水漂洗干凈。計數(shù)>50個細胞的集落數(shù)目，計算：貼壁率(PE)=對照組集落形成數(shù)÷種植細胞數(shù)×100%；存活率(SF)=(實驗組集落形成數(shù)÷細胞種植數(shù))÷貼壁率。用單擊多靶模型擬合細胞存活曲線，計算放射生物學參數(shù)。實驗重復3次。將穩(wěn)定表達Control和SNHG11的SMMC-7721細胞、sh-con和sh-SNHG11的SK-Hep1細胞株按照梯度細胞密度進行鋪板培養(yǎng)，劑量梯度照射，然后計算克隆形成率，按照公式y(tǒng)=1-[1-exp(-kx)]N擬合細胞存活曲線并計算放射生物學參數(shù)[11-12]。

1.10 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件，進行單因素方差分析及LSD-t檢驗，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 構建敲低和過表達SNHG11細胞模型 我們在幾株肝癌細胞中檢測SNHG11的表達水平，最終確定SNHG11表達水平較高的SMMC-7721細胞構建穩(wěn)定敲低細胞株，表達水平低的SK-Hep1細胞構建過表達細胞株。我們在SK-Hep1細胞中轉染sh-con和sh-SNHG11，在SMMC-7721細胞中轉染Control和SNHG11慢病毒質(zhì)粒后，Control、SNHG11、sh-con與sh-SNHG11組SNHG11的mRNA表達量分別為1.00±0.00、93.68±3.80、1.39±0.14和0.26±0.05。見圖1。

*與Control比較P<0.05;△與sh-con比較P<0.05圖1 qRT-PCR檢測SNHG11的mRNA表達量

2.2 放療敏感性 過表達SNHG11后細胞放射生物學參數(shù)N、Do、Dq、SF2分別為對照組(Control)的1.14、2.15、2.20、1.21倍，而敲低SNHG11(sh-SNHG11組)后N、Do、Dq、SF2分別為對照組(sh-con)的0.78、0.16、0.41、0.55倍，過表達SNHG11導致細胞放療抵抗，而敲低SNHG11后細胞放療敏感性增加。見圖2和表1。

A:sh-con與sh-SNHG11;B:Control與SNHG11圖2 單擊多靶模型擬合細胞存活曲線

表1 單擊多靶模型參數(shù)值

2.3 DNA損傷相關蛋白檢測 在4 Gy放療情況下，過表達SNHG11后γH2AX表達水平較Control組低，而敲低SNHG11后表達水平隨時間增加。見圖3、表2。

2.4 放療情況下細胞凋亡相關蛋白檢測 放療可以增加細胞中凋亡蛋白c-caspase3的表達，而過表達SNHG11能部分逆轉c-caspase3的表達上調(diào)，敲低SNHG11可以進一步促進凋亡蛋白表達。見圖4、表3。

3 討論

研究表明放療在肝癌中發(fā)揮越來越重要的作用，其中SBRT可以使小肝癌2年局部控制率達到85%以上，在局部晚期肝癌患者中2年局部控制率達到接近40%～60%[5-6]，但是仍然有部分肝癌患者因放射抵抗導致腫瘤控制不佳進而預后較差。因此尋找肝癌放射抵抗的分子機制，對提高肝癌患者在放療局部控制率方面有著非常重要的意義。

在本研究中，我們使用單擊多靶模型擬合細胞存活曲線，從而計算放射生物學參數(shù)N、Do、Dq、SF2、k。

圖3 Western blot檢測DNA損傷修復蛋白在4 Gy照射下隨時間的表達變化表2 不同處理組γH2AX的表達水平

組別0 h2 h4 h6 hControl63.59±1.2469.22±0.4174.98±1.4263.58±1.68SNHG1146.75±2.02?31.50±2.15?45.13±0.03?57.75±1.22?sh-con49.75±0.2396.60±1.3096.25±1.1793.82±2.52sh-SNHG1190.83±2.78△83.91±1.61△81.03±0.55△77.57±0.42△

*與Control比較P<0.05；△與sh-con比較P<0.05

圖4 Western blot檢測c-caspase3、總caspase3的表達

表3 不同處理組c-caspase、caspase的表達水平

*與Control+IR比較P<0.05；△與sh-con+IR比較P<0.05

這些衡量放射敏感性的參數(shù)能夠較真實全面地反映細胞放射生物學特性，已被廣泛應用于細胞放射敏感性的分析。這些參數(shù)分別從不同角度反映細胞放射敏感性，N值反映細胞對放射引起損傷的修復能力(k=1/N)，Dq是細胞受損所需要的閾量，Do為曲線指數(shù)區(qū)下降63%所需要的劑量，SF2是2 Gy時的細胞存活分數(shù)，這些指標數(shù)值越大，代表放射抵抗性增強[11-13]。通過計算放射生物學參數(shù)，我們認為SNHG11可以促進肝癌細胞放療抵抗。

腫瘤細胞放射抵抗的產(chǎn)生是多基因、多因子、多步驟及多重機制共同作用的結果。腫瘤細胞受到射線照射后，造成DNA雙鏈斷裂，激活DNA損傷修復信號通路，從而促進腫瘤細胞的存活，因此腫瘤中DNA損傷修復通路的過度激活可以促進腫瘤細胞在射線照射下的存活，也就是說，DNA損傷修復增強是腫瘤細胞放射抵抗的重要原因[14-15]。我們發(fā)現(xiàn)SNHG11高表達的肝癌細胞對射線抵抗，提示lncRNA在腫瘤細胞放射抵抗中發(fā)揮重要的作用，可能是由于SNHG11的高表達使得DNA損傷修復通路激活增強。H2AX為染色體組蛋白H2A家族的成員之一，在各種理化因素的刺激下，細胞DNA雙鏈斷裂，H2AX被磷酸化成為γH2AX。γH2AX作為一種生物標志物，能夠清楚反映DNA損傷修復和修復的情況[16-18]。γH2AX是DNA損傷修復通路中的重要分子，是DNA損傷重要的標志，其表達升高提示DNA損傷加重，出現(xiàn)時間快提示DNA損傷出現(xiàn)早，消退時間快提示DNA損傷修復加快。本研究我們發(fā)現(xiàn)在肝癌細胞中過表達SNHG11，射線誘導的γH2AX表達降低，提示SNHG11降低了射線誘導的DNA損傷，并加快了DNA損傷修復過程，提示SNHG11可能是通過增強射線引起的DNA損傷修復增加，進而增加肝癌細胞的放射抵抗。

放療能夠導致DNA雙鏈斷裂，啟動細胞對DNA的修復機制，而無法被修復的損傷將引起細胞凋亡[19-21]。射線可以通過增加腫瘤細胞的凋亡達到控制腫瘤細胞增殖的目的，因此我們猜想SNHG11導致腫瘤細胞放射抵抗可能與細胞凋亡相關。細胞內(nèi)蛋白酶的級聯(lián)活化是凋亡的一個重要標志，這些蛋白酶中主要是caspase。在凋亡發(fā)生時，caspase能夠被剪切成活化狀態(tài)，如c-caspase3[22-23]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SNHG11過表達的肝癌細胞射線誘導的c-caspase3表達減少，而SNHG11沉默表達的肝癌細胞射線誘導的c-caspase3增加，而總的caspase水平?jīng)]有明顯變化，提示SNHG11可以抑制射線誘導的肝癌細胞的凋亡。

已有大量的研究表明lncRNA在肝癌增殖、侵襲轉移、代謝等方面發(fā)揮重要作用[24-25]，例如lncRNA-UFC1可以通過激活β-catenin促進肝癌細胞的增殖[26]，SNHG6可以通過發(fā)揮內(nèi)源性ceRNA的作用促進肝癌細胞的增殖、侵襲轉移等[27]。而對于lncRNA影響腫瘤細胞放射敏感性的研究較少，并且大多數(shù)是對宮頸癌、鼻咽癌、膠質(zhì)瘤等癌種，例如lncRNA-GAS5 能夠通過調(diào)控miR-106b/IER3信號軸來增強宮頸癌細胞放射敏感性[28]；lncRNA ANCR通過抑制PTEN的表達促進鼻咽癌細胞的放療抵抗性[29]。然而，對于lncRNA在肝癌放射抵抗中的作用卻鮮有報道，而我們的研究對于證明lncRNA參與肝癌細胞對射線抵抗提供了強有力的證據(jù)，但是SNHG11如何調(diào)控肝癌細胞DNA損傷修復通路，其中的具體機制仍需進一步探討。