文/Kevin Grant,Matt Quinn

提高極小體積樣品定性和定量測量的效率和重現(xiàn)性 // 紫外-可見分光光度計測量為樣品的質量控制檢查提供了一種快速可靠的方法。它們還可用于計算比活性或估算純化后的產(chǎn)率，并鑒定含有蛋白質和氨基酸的組分。

含有芳香側鏈氨基酸的蛋白質，在接近280 nm處產(chǎn)生吸收。因此可以使用紫外-可見分光光度計進行定量分析。當吸收系數(shù)已知時，可根據(jù)比爾-朗伯定律確定含有氨基酸的蛋白質的濃度。通常蛋白質的樣品量有限，以最少體積進行測量對于樣品的保存至關重要。通過波長掃描可提供潛在污染物的信息。Cary 3500多池紫外-可見分光光度計具有永久光學準直的集成式多池支架，與超微量比色皿（如圖1所示），配合使用，適用于可靠、可重現(xiàn)的定性及定量測量。依據(jù)Cary 3500多池紫外-可見分光光度計在小體積蛋白質樣品定性和定量分析方面的優(yōu)勢。以牛血清白蛋白 (Bovine serum albumin, BSA) 為蛋白質標準品進行本次實驗。

實驗部分

樣品

配制 pH 7.0 的 0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液 (PBS)。

配制10 mg/mL BSA 儲備液，并稀釋至 0.75、1.50、2.25、3.00和3.75 mg/mL。

使用六個孔徑為2×2.5 mm，容積70 μL，光程10 mm的超微量比色皿進行測量，見圖1。其中，一個作為參比，五個作為樣品。使用3.5 mL、10 mm光程的標準石英比色皿進行重現(xiàn)性測量。采用PBS 緩沖液作為參比溶液。

圖1 Cary 3500 多池紫外-可見分光光度計具有高度聚焦的光束，寬度小于1.5 mm。

儀器和方法

所有測量均使用Cary 3500多池紫外-可見分光光度計。在250-350 nm范圍內進行波長掃描，信號采集平均時間為1秒，數(shù)據(jù)間隔為1 nm。無需預先校準系統(tǒng)

為證明重現(xiàn)性，用超微量比色皿(70 μL) 重復測量3.0 mg/mL BSA 溶液20次，其中參比位置為裝有 PBS 緩沖液的相同超微 量比色皿。此外，使用3.5 mL、10 mm光程的標準石英比色皿對同樣的溶液進行另外20次重復測量，以裝有PBS緩沖液的相同比色皿作為參比。這些測量均在278 nm處進行，信號采集平均時間為1秒，光譜帶寬為2 nm。

結果

同步測量

空白樣品和五種濃度BSA樣品在Cary 3500多池紫外-可見分光光度計中使用超微量比色皿（2×2.5 mm孔，10 mm光程）進行同步測量。在250-350 nm范圍內進行波長掃描以定性分析樣品，見圖 2。然后將這些數(shù)據(jù)用于評估儀器的線性（參見下文微量池部分中的線性）。

圖2 70μL 超微量比色皿中同步收集的五種濃度 BSA 樣品的波長掃描結果。

蛋白質純度350 nm處的吸收強度可用于定量和校正存在于蛋白質樣品中的任何污染物。從圖2可以看出，該測量樣品在350 nm處的吸光度為0 Abs。因此，這些樣品中BSA的濃度與光譜圖的峰最大值成正比，根據(jù)這一關系可準確測定BSA的濃度。無需雜質校正。

微量池線性

很明顯，每個BSA波長掃描的峰最大值均出現(xiàn)在278 nm處，見圖 2。使用Cary 3500紫外工作站軟件提取每個樣品在278 nm處峰的吸收強度，并將其對每種所測樣品中的蛋白質濃度作圖，如圖3所示。這些數(shù)據(jù)清晰地展示了Cary 3500系統(tǒng)的線性，見圖3。結果表明，線性范圍擴展至接近2.5 Abs，即使使用小孔超微量比色皿也是如此。

重現(xiàn)性

為 證 明 重 現(xiàn) 性， 在 70 μL、2×2.5 mm孔徑的超微量比色皿或3.5 mL標準比色皿中重復測量3.0 mg/mL BSA 樣品20次。 兩種比色皿的光程均為10 mm。超微量比色皿較小的窗口孔徑尺寸對測量的重現(xiàn)性（標準偏差）無影響，如圖4 所示。70 μL超微量比色皿的測量標準偏差為0.00042，3.5 mL標準 比色皿為0.00029。使用超微量比色皿測得的吸光度平均值為1.863 Abs。使用3.5 mL標準比色皿測得的吸光度平均值為1.858 Abs。兩種比色皿所得結果的差異在儀器的測量不確定度范圍內。

使用小體積比色皿的風險在于較小的比色皿窗口（通常為比色皿設計的一部分）孔徑導致光通量減小。光通量減少會使線性吸光度范圍和測量重現(xiàn)性降低。Cary 3500具有高度聚焦的光束，可確保以最大光通量通過樣品，且重現(xiàn)性與3.5 mL標準比色皿相同，如圖4所示。

討論

如果已知吸收系數(shù)，可通過紫外-可見光譜圖上的最大吸收強度進行定量測量，如此處測量的BSA樣品，其吸收系數(shù)已知。如果吸收系數(shù)未知，則必須通過測量多個標準品建立校準曲線，并根據(jù)校準曲線的斜率計算吸收系數(shù)。這是一個耗時的過程，并可能引起在實驗結束前都無法確定的測量誤差。分析人員可以選擇在分析序列中加入已知濃度的樣品來提高數(shù)據(jù)的可靠性。這些加入的樣品充當內部對照。這種測量方法的問題在于不能同時測量樣品和標準品，因而在樣品和標準品測量之間各種變量可能發(fā)生改變。如本文所述，同步進行樣品和標樣測試可大大減小其他環(huán)境變量或可能影響樣品前處理的偏差。

在測量可能不穩(wěn)定的樣品時，一次測量一個樣品的方法可能會導致結果錯誤。將樣品置于實驗臺等待測量的過程中，它們的吸光度可能會發(fā)生改變。引起這一改變的原因可能為溫度變化、照射到溶液的光線的影響或溶液中的化學變化。這可能導致定量測量時出現(xiàn)系統(tǒng)誤差。通過同步測量所有比色皿位置，Cary 3500多池紫外-可見分光光度計可消除這些不利變量，并提高所生成結果的可靠性。同時，還可顯著節(jié)省測量時間。

圖3 對五種BSA樣品278 nm處的吸光度和濃度作圖，展示了Cary 3500多池紫外-可見分光光度計的線性。

圖4 70μL超微量比色皿與3.5 mL標準比色皿重復測量20次的吸光度比較。

結論

Cary 3500 多池紫外-可見分光光度計為蛋白質的定性和定量分析帶來了新的可能。該系統(tǒng)采用獨特的非移動式整體多池支架，專為提高分析效率和重現(xiàn)性而設計。通過同步測量八個比色皿位置，可有效減少任何可能在后續(xù)測量過程中出現(xiàn)的不利變量。這些特點共同造就了一個強大的分析型紫外-可見分光 光度計系統(tǒng)。