吳偉力 應(yīng)于康 羅 軍

牙周炎是一種以牙周支持組織慢性細(xì)菌感染為特征的疾病[1]。上皮屏障是防御細(xì)菌入侵的第一道防線，其完整性對于牙周疾病控制中起著至關(guān)重要的作用[2]。當(dāng)上皮屏障被破壞時，形成牙周袋，微生物和結(jié)締組織之間直接接觸。白細(xì)胞介素-22(IL-22)是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)宿主防御反應(yīng)，在糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性鼻炎等疾病中都有發(fā)現(xiàn)，主要由CD4+T細(xì)胞分泌，同時Th-17和Th-22細(xì)胞也能分泌，主要調(diào)控上皮細(xì)胞的再生功能[3,4]。IL-22的調(diào)控作用是通過IL-22受體(IL-22R)來發(fā)揮作用，IL-22R由白細(xì)胞介素-22受體1(IL-22R1)和共享亞基白細(xì)胞介素-10受體2(IL-10R2)組成[5]。IL-22R1只在特定的組織(如黏膜和皮膚的上皮細(xì)胞)等表達(dá)[6]。同時，IL-22結(jié)合蛋白(IL-22BP)也可以與IL-22 結(jié)合，抑制IL-22與IL-22R結(jié)合，IL-22的功能結(jié)果取決于IL-22R1和IL-22BP的水平之間的平衡[7，8]。目前，關(guān)于IL-22及其受體在牙周炎發(fā)生、發(fā)展過程中的作用研究較少。因此，本研究通過探討不同牙周炎病理時期組織學(xué)改變和IL-22、IL-22R1和IL-22BP的表達(dá)，旨在為牙周炎的診療帶來新的思路。

材料與方法

1.實驗動物:選取體重(200～240g)的雄性健康8周齡SD大鼠30只，購自山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，實驗動物許可證號: SCXK(魯)2012-0002，動物合格證編號：2005001。動物飼養(yǎng)在溫度為22～24℃、噪聲≤50dB、相對濕度為40%～70%的SPF環(huán)境中，動物相關(guān)處置均符合《中華人民共和國實驗動物管理條例》要求，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗。

2.實驗試劑:牙齦卟啉單胞菌購自上海北諾生物科技有限公司，批號：LLL661；水合氯醛購自上海上藥新亞藥業(yè)有限公司，批號：781200008；硫酸卡那霉素購自江西制藥有限責(zé)任公司，貨號：14200204181；Trizol Reagent RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司，貨號：15596018；Prime Script RT reagent Kit Perfect real-time RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Ultra SYBR One Step RNA PCR Kit熒光定量PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號：RR047A、TK08045；PCR引物序列購自日本TaKaRa公司：IL-22上游引物：5′-AAGCTCAGCAGTCACCTCA-3′,下游引物：5′-GGGACATAAACAGCAGATCCA-3′；IL-22R1上游引物：5′-TGGTCCCCCAGCAGTCATTT-3′，下游引物：5′-TCTTGACCACTGCCACAGAAA-3′；IL-22BP上游引物：5′-CCCGTTGCTTTTCCTCTGG-3′，下游引物：5′-ATCCCACTCGTAGCCCCTCT-3′；beta-actin引物序列：上游引物：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′；IL-22、IL-22R1、IL-22BP ELISA 試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司，貨號：MM-0670R2、MM-0670R1、MM-0670R22。

3.實驗儀器：體視顯微鏡Stemi 2000購自奧地利SEZ公司；光學(xué)生物學(xué)顯微鏡購自日本Nikon公司；NanoDrop2000c 型蛋白核酸檢測儀購自美國Thermo公司；實時熒光定量PCR儀購自美國BIO-RAD公司。HBS-1096B 酶標(biāo)儀購自南京德鐵實驗設(shè)備有限公司；臺式冷凍離心機(jī)Sorvall STR ATOS購自德國Heraeus公司；5.0 絲線購自江蘇泗洪金睛醫(yī)療器械有限公司。

4.實驗分組及造模：采用數(shù)字法將SD大鼠隨機(jī)均分為5組，即對照組、建模1周組、建模2周組、建模3周組、建模5周組，每組6只。造模前3天給予硫酸卡那霉素水溶液(1g/L)喂養(yǎng)除菌。禁食12h后用10%水合氯醛(3.33ml/kg)腹腔注射麻醉后，采用高糖飲食+絲線結(jié)扎+接種牙齦卟啉單胞菌的方法造模。絲線結(jié)扎雙側(cè)上頜第一磨牙上，將絲線推入齦溝深部，在齦溝內(nèi)接種1.5×109CFU/ml的牙齦卟啉單胞菌，結(jié)扎后給予50g/L高糖水替代飲用水。每隔1天接種1次牙齦卟啉單胞菌。在各時間節(jié)點分別取雙側(cè)上頜軟組織，一側(cè)置于Trizol液中，另一側(cè)不加處理，均放于-80℃保存?zhèn)溆?；剔除上頜軟組織，一側(cè)上頜骨置于雙氧水(3%)中，另一側(cè)置于多聚甲醛液(4%)中，24h后進(jìn)行脫鈣。

5.HE染色觀察牙周組織病理改變：取脫鈣的上頜組織進(jìn)行脫水、包埋、切片(3μm)、HE染色、封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察牙周組織病理改變并拍照。

6.檢測牙槽骨吸收：取置于雙氧水中上頜骨，用漂泊劑(10g/L)浸泡1min，刷洗去除軟組織，用亞甲藍(lán)(10g/L)染色1min，用蒸餾水沖洗，晾干后用體視顯微鏡下觀察并拍照，用 Image J軟件計算腭側(cè)多邊形面積。

7.ELISA法檢測上頜軟組織中IL-22、IL-22R1、IL-22BP的含量：取適量上頜軟組織，用磷酸鹽緩沖液清洗，制成勻漿，吸取上清液進(jìn)行實驗。根據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行IL-22、IL-22R1、IL-22BP含量測定。

8.RT-PCR檢測上頜軟組織中IL-22、IL-22R1、IL-22BP mRNA的表達(dá)：取置于Trizol液中的上頜軟組織，依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行總RNA的提取和cDNA的合成，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對其表達(dá)量進(jìn)行結(jié)果分析，β-actin作為內(nèi)參，采用 2-△△Ct法計算mRNA 的相對表達(dá)量。

結(jié) 果

1.各組HE染色結(jié)果:對照組牙周組織沒有發(fā)現(xiàn)炎癥和軟組織損傷；在建模1周可以觀察到上皮損傷好輕度炎性細(xì)胞浸潤；建模第2周逐漸加重，在建模第3周達(dá)到高峰期，上皮屏障的完整性被破壞；建模第5周炎癥減輕，上皮細(xì)胞增生和屏障完整性的恢復(fù)，從而形成了牙周袋,詳見圖1。

圖1 各組HE染色結(jié)果(×20)A.對照組;B.牙周炎1周組;C.牙周炎2周組;D.牙周炎3周組;E.牙周炎5周組

2.各組牙槽骨吸收比較:與對照組比較，各牙周炎組大鼠牙槽骨吸收明顯，根分叉逐漸暴露，腭側(cè)多邊形面積增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；隨著造模時間的延長，牙槽骨吸收逐漸加重、腭側(cè)多邊形面積增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1、圖2。

表1 各組牙槽骨吸收比較

與對照組比較，*P<0.05；與建模1周組比較，#P<0.05；與建模2周組比較，ΔP<0.05

圖2 各組牙槽骨吸收比較(×10)A.對照組;B.建模1周組;C.建模2周組;D.建模3周組;E.建模5周組

3.各組上頜軟組織中IL-22、IL-22R1、IL-22BP的含量:與對照組比較，各牙周炎組大鼠上頜軟組織中IL-22和IL-22R1 含量增加，IL-22BP 含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；隨著造模時間的延長，IL-22和IL-22R1 含量增加，在第3周達(dá)到高峰，第5周含量有所降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；IL-22BP 含量降低，在第3周達(dá)到低谷，第5周有所增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

4.各組上頜軟組織中IL-22、IL-22R1、IL-22BP mRNA的表達(dá):與對照組比較，各牙周炎組大鼠上頜軟組織中IL-22和IL-22R1 mRNA相對表達(dá)量增加，IL-22BP mRNA相對表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；隨著造模時間的延長，IL-22和IL-22R1 mRNA相對表達(dá)量增加，在第3周達(dá)到高峰，第5周有所降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；IL-22BP mRNA相對表達(dá)量降低，在第3周達(dá)到低谷，第5周有所增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見表3。

表2 各組上頜軟組織中IL-22、IL-22R1、IL-22BP的含量

與對照組比較，*P<0.05；與建模1周組比較，#P<0.05；與建模2周組比較，ΔP<0.05；與建模3周組比較，▲P<0.05

表3 各組上頜軟組織中IL-22、IL-22R1、IL-22BP mRNA的表達(dá)

與對照組比較，*P<0.05；與建模1周組比較，#P<0.05；與建模2周組比較，ΔP<0.05；與建模3周組比較，▲P<0.05

討 論

牙周炎是一種感染性疾病，主要表現(xiàn)為牙齒支持組織侵犯性的破壞[9]。IL-22具有抗菌作用，增強(qiáng)細(xì)胞再生能力，保護(hù)組織受損，在維持黏膜屏障的完整性和對感染控制方面起著關(guān)鍵作用[10,11]?；谝陨涎芯炕A(chǔ)，本研究對牙周炎的老鼠IL-22以及其受體、組織學(xué)改變情況。結(jié)果顯示，炎癥在第3周達(dá)到頂峰，之后到第5周可認(rèn)為是一個恢復(fù)階段，同時出現(xiàn)了上皮細(xì)胞增生。同時，從第1周到第3周，上皮組織的完整性破壞越來越嚴(yán)重，牙槽骨丟失的數(shù)量仍然呈指數(shù)增長。提示上皮屏障的破壞、黏膜免疫的增強(qiáng)和骨吸收增強(qiáng)三者之間的關(guān)系是相輔相成的。通過對牙槽骨吸收相關(guān)研究的搜索可以發(fā)現(xiàn)，炎癥使上皮屏障受到破壞，病原菌與組織直接接觸，誘導(dǎo)了破骨細(xì)胞的形成并增加破骨細(xì)胞的活動，使牙槽骨丟失[12～14]。因此，本研究結(jié)果表明，上皮組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)改變可能對骨骼吸收有影響。

本研究對大鼠上頜軟組織中IL-22、IL-22R1 mRNA和蛋白的檢測中發(fā)現(xiàn)，IL-22、IL-22R1表達(dá)水平也有和組織學(xué)改變相同的趨勢?；贗L-22具有促進(jìn)上皮細(xì)胞再生和保護(hù)組織受損的功能，本研究顯示，當(dāng)機(jī)體受到細(xì)菌感染時，宿主可能會產(chǎn)生更高水平的IL-22來恢復(fù)上皮的屏障作用。在對炎性腸病和實驗性自身免疫性心肌炎的研究中也可以看到類似的情況，并證明了IL-22的作用[15，16]。同時，牙周炎患者的唾液中也發(fā)現(xiàn)IL-22的比率較正常人升高，提示 IL-22可能參與牙周炎免疫反應(yīng)[17]。有研究者提出IL-22的表達(dá)水平可作為牙周組織破壞程度的指標(biāo)，因為IL-22牙周組織中的表達(dá)與牙周炎的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，控制IL-22的水平對牙周炎的治療有積極的意義[18]。IL-22屬于IL-10細(xì)胞因子家族，IL-22功能的發(fā)揮需要通過與IL-22R1的結(jié)合來實現(xiàn)，IL-22BP可以與IL-22R1競爭性地IL-22結(jié)合，使IL-22失活，同時，IL-22BP與IL-22的結(jié)合能力比IL-22R1強(qiáng)[19]。所以，IL-22的活性主要取決于能否與IL-22R1相結(jié)合，而IL-22BP被認(rèn)為是IL-22失活的天然中和抗體。在對胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-22BP水平降低可以推動IL-22不受控制的促進(jìn)細(xì)胞增殖，導(dǎo)致胃炎相關(guān)模型修復(fù)階段癌癥的發(fā)生。IL-22和IL-22R1相同趨勢的原因可能與IL-22誘導(dǎo)的正反饋調(diào)節(jié)增加IL-22R1的表達(dá)，IL-22BP則相反。這一結(jié)論在葡聚糖硫酸鈉誘發(fā)結(jié)腸炎模型中得到證實。

綜上所述，本研究確定了在大鼠的實驗性牙周炎中上皮細(xì)胞的組織病理變化過程及IL-22、IL-22R1和IL-22BP時序性表達(dá)情況，可為牙周炎的診療帶來新的思路。但本研究不能證明IL-22、IL-22R1和IL-22BP是否與上皮細(xì)胞增殖有關(guān)，需要筆者在今后的研究中予以證實。