王永久 宮珍卿 程 焱

復發(fā)性腦卒中的致殘率和致死率遠遠高于單次腦卒中發(fā)作，因此在首次腦卒中發(fā)作后應用神經(jīng)保護劑預防腦卒中復發(fā)導致的神經(jīng)元損害非常重要。白藜蘆醇(resveratrol, RSV)是一種多酚化合物，在心血管和神經(jīng)變性動物模型中的保護作用已經(jīng)得到證實[1, 2]。然而其參與相關(guān)調(diào)節(jié)作用的細胞和分子機制仍不清楚。沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(silent information regulatorT1, SIRT1)是抗老化基因，在腦缺血時SIRT1活性增強，細胞生命周期延長，抵抗應激能力增加，對致命性腦缺血起到神經(jīng)保護作用[3, 4]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)是細胞內(nèi)的能量開關(guān)，急性腦缺血后AMPK激活可導致能量衰竭、代謝障礙增加、神經(jīng)功能損害，而抑制AMPK磷酸化可減輕MCAO模型的神經(jīng)功能損害[5, 6]。AMPK的激活可通過磷酸化起到類他汀類藥物的調(diào)脂和神經(jīng)保護作用[7, 8]。因此，本研究旨在探討白藜蘆醇對復發(fā)大鼠缺血性腦卒中的神經(jīng)保護功能，及其與SIRT1/AMPK信號通路的相關(guān)作用機制。

材料與方法

1.單次和復發(fā)動物模型制備:18～20月齡成年雄性Wistar大鼠38只，由山東大學動物中心提供，于實驗室內(nèi)適應性飼養(yǎng)1周，室溫25～30℃，自由飲水、進食，自然光照。術(shù)前12h禁食。參照Qiao等[9]的方法，大鼠復發(fā)MCAO模型采用微動脈瘤夾夾閉大腦中動脈(middle cerebral artery, MCA)，簡單來說，大鼠用異氟烷吸入麻醉(4%誘導麻醉，2%維持)，麻醉后的大鼠取側(cè)臥位，在右眼和右外耳間做一條長約10mm的縱切口，分離組織，暴露顳骨，在鼻裂處用微鉆頭鉆一小孔A(直徑2mm)以暴露MCA，在A孔背側(cè)3mm處(即MCA近端)鉆一小孔B，在A孔后側(cè)3mm處(即MCA遠端)鉆一小孔C。用激光多普勒儀探頭監(jiān)測B孔和C孔處局部腦血流量(regional cerebral blood flow，rCBF)，用微動脈瘤夾夾閉MCA，同時用血管鉗夾閉雙側(cè)頸總動脈。檢測rCBF下降90%以上認為MCAO模型成功。在MCA缺血40min后去掉微動脈瘤夾和血管鉗，這樣單次MCAO模型成功。單次MCAO模型成功的大鼠喂養(yǎng)3天，在第4天進行第2次MCAO模型手術(shù)，手術(shù)過程同上述方法，這樣雙次MCAO模型成功。在術(shù)中及術(shù)后保持直腸溫度在37.0～37.5℃，PE50導管插入股動脈，外接動脈血壓檢測儀，進行持續(xù)動脈血壓檢測。

2.干預措施:大鼠按照數(shù)字表法隨機分為假手術(shù)組、單次MCAO模型組、雙次MCAO模型組，每組又分為實驗對照組(予以含15%～20%凝膠的可口飼料作為安慰劑)和RSV治療組[25mg/(kg·d)喂養(yǎng)]。雙次MCAO模型組在第1天行MCAO術(shù)后，用安慰劑或RSV喂養(yǎng)3天，第4天進行第2次MCAO手術(shù)，繼續(xù)喂養(yǎng)3天至第7天進行行為學測試。單次MCAO模型組先喂養(yǎng)3天，第4天進行首次MCAO手術(shù)，繼續(xù)喂養(yǎng)3天至第7天進行行為學測試。假手術(shù)組制作步驟同上，但不夾閉MCA，詳見表1。

表1 大鼠分組情況 (n)

3.觀察指標:(1)行為學測定:由1名不知情者應用水平梯任務和圓柱體任務對大鼠的神經(jīng)行為功能進行評分[10, 11]。(2)TTC染色測量腦梗死體積:大鼠在喂養(yǎng)7天后，10%水合氯醛麻醉，斷頭取腦，采用Jacobowitz 腦切片儀自前向后連續(xù)冠狀切片(厚度2mm)，置入含2%TTC溶液中，37℃避光孵育10min。正常組織呈鮮紅色，壞死區(qū)呈蒼白色。拍照后應用圖像分析儀(Axiovision LE 4.1, Carl Zeiss, Jena, Germany)計算梗死體積。校正的測量梗死面積=測量的梗死面積×{1-[(同側(cè)半球面積-對側(cè)半球面積)/N側(cè)半球面積]}。根據(jù)公式V=t(A1+A2+A3+…An)計算出體積，n為單個鼠腦切片數(shù)，t為切片厚度，A為每個切片梗死面積[12]。(3)標本的制備:用于活性測定、蛋白表達和ATP水平測定的腦組織標本均采用以下方法制備。大鼠水合氯醛麻醉后迅速斷頭取腦，取缺血周圍腦組織標本約100mg，立即浸泡于液氮中，隨后于-70℃保存。(4)SIRT1去乙?；钚詼y定:上述腦組織標本加適量裂解液孵育1h，離心取上清液進行SIRT1活性測定。SIRT1活性測定采用去乙酰化熒光檢測試劑盒(CycLex, Ina,日本長野公司)進行[13]。在加入熒光底物肽和蛋白質(zhì)濃度標準化后，反應板在室溫下孵育45min，用熒光度儀測定熒光強度(Ex: 350nm, Em: 450nm)。(5)Western blot法印跡檢測SIRT1、AMPK及phospho-AMPK表達：上述腦組織加入細胞裂解液，冰浴20min，4℃12000r/min離心10min，取上清液，Lowry法測定蛋白濃度。制備SDS-PAGE凝膠，加樣電泳，半干法轉(zhuǎn)膜。室溫封閉2h后，加入一抗(SIRT11:500、AMPK1:1000、phospho-AMPK1:1000)，4℃過夜，二抗(1∶600)室溫孵育2h。以β-actin作為內(nèi)參。利用Model GS-700圖像顯像儀測定各條帶的灰度值。計算各目的蛋白的相對灰度值(relative value of protein，RVP)。(6)ATP水平測定:上述腦組織冰浴勻漿裂解，4℃15000r/min 離心1min，取上清進行ATP含量測定。參照Troyano等[14]的研究方法，采用ATP生物發(fā)光檢測試劑盒(Bioluminescence Assay kit CLSII，羅氏診斷，西班牙)，應用LuminMax-C 冷光儀檢測發(fā)光樣品強度含量，根據(jù)ATP標準品繪制標準曲線，計算樣本的ATP含量。

結(jié) 果

1.大鼠MCAO模型rCBF監(jiān)測:大鼠MCA近側(cè)及遠側(cè)rCBF比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組的大鼠腦缺血核心區(qū)rCBF均下降90%以上，說明大鼠MCAO模型制備成功，詳見表2。

表2 缺血核心區(qū)rCBF (%)

2.RSV對MCAO大鼠行為學影響:實驗結(jié)果顯示雙次MCAO大鼠的行為學缺損比單次MCAO嚴重(P<0.05)。在水平梯任務實驗，RSV治療組較對照組的步態(tài)錯誤發(fā)生率顯著降低。在圓柱筒任務實驗，RSV治療組較對照組的非對稱積分顯著降低,詳見圖1。

圖1 RSV對MCAO大鼠行為學影響A.假手術(shù)組；B.單次MCAO組；C.雙次MCAO組；與A比較，*P<0.05；與B比較，#P<0.05

3.RSV對MCAO大鼠腦梗死體積影響：TTC染色結(jié)果顯示雙次MCAO模型梗死體積顯著大于單次MCAO模型。單次MCAO模型大鼠的梗死灶呈散在的點狀分布，腦梗死體積較小，經(jīng)過RSV處理后腦梗死體積顯著變小，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。雙次MCAO模型大鼠皮質(zhì)出現(xiàn)明顯的大面積梗死，而經(jīng)過RSV治療的腦梗死體積顯著變小，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見圖2。

圖2 RSV對單次和雙次MCAO腦梗死體積影響Ⅰ.單次MCAO實驗對照組；Ⅱ.單次MCAO RSV治療組；Ⅲ.雙次MCAO實驗對照組； Ⅳ.雙次MCAO RSV治療組；A.單次MCAO組；B.雙次MCAO組；與同組實驗對照組比較，*P<0.05；與A比較，#P<0.05

4.RSV對復發(fā)腦缺血大鼠腦組織SIRT1活性和SIRT1蛋白表達影響:與實驗對照組比較，假手術(shù)組、單次MCAO組和雙次MCAO組經(jīng)RSV治療后SIRT1活性顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(圖3，P<0.05)，而SIRT1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(圖4，P>0.05)。與假手術(shù)實驗對照組比較，單次MCAO組SIRT1活性顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而雙次MCAO組SIRT1活性差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖3 RSV對各組SIRT1活性影響A.假手術(shù)組；B.單次MCAO組；C.雙次MCAO組；與同組實驗對照組比較，*P<0.05；與假手術(shù)實驗對照組比較，#P<0.05

圖4 RSV對各組SIRT1蛋白表達影響A.假手術(shù)組；B.單次MCAO組；C.雙次MCAO組

5.RSV對復發(fā)腦缺血大鼠腦組織AMPK活性影響：本實驗通過檢測AMPK-Thr-172的磷酸化來檢測AMPK活性。與實驗對照組比較，RSV喂養(yǎng)后假手術(shù)組、單次MCAO組和雙次MCAO組AMPK磷酸化顯著增加(P<0.05)。與假手術(shù)實驗對照組比較，單次MCAO組AMPK磷酸化顯著增加(P<0.05)，雙次MCAO組AMPK磷酸化比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見圖5。

圖5 RSV對各組AMPK磷酸化表達影響A.假手術(shù)組；B.單次MCAO組；C.雙次MCAO組；與同組實驗對照組比較，*P<0.05；與假手術(shù)實驗對照組比較，#P<0.05

6.RSV對復發(fā)腦缺血大鼠腦組織ATP水平影響：與假手術(shù)實驗對照組比較，單次和雙次MCAO顯著降低大鼠缺血腦組織ATP含量(P<0.05)，雙次MCAO后缺血腦組織ATP含量僅為假手術(shù)組的17%，RSV喂養(yǎng)后假手術(shù)組、單次和雙次MCAO組大鼠缺血腦組織ATP含量顯著增高(P<0.05)，RSV使組織內(nèi)ATP含量升高1.5～2.0倍,詳見圖6。

圖6 RSV對各組ATP水平影響A.假手術(shù)組；B.單次MCAO組；C.雙次MCAO組；與假手術(shù)實驗對照組比較，*P<0.05；與同組實驗對照組比較，#P<0.05

討 論

約23%缺血性腦卒中發(fā)病前有短暫性腦缺血發(fā)作(transient ischemic attack, TIA)或小卒中(minor stroke)發(fā)作，約10.5%的反復腦卒中或TIA發(fā)作的患者是在首次發(fā)作后90天內(nèi)出現(xiàn)雙次發(fā)作，且50%的雙次發(fā)作發(fā)生在首次發(fā)作后2天內(nèi)[15，16]。因此在首次腦卒中發(fā)作后應用神經(jīng)保護劑預防腦卒中復發(fā)導致的神經(jīng)元損害非常重要。本研究參照Qiao等[9]的研究方法成功制備了復發(fā)缺血性腦卒中模型。

研究發(fā)現(xiàn)RSV具有抗氧化、抗炎、抗細胞凋亡等作用，對代謝、心血管和其他與年齡有關(guān)的并發(fā)癥(包括神經(jīng)變性和癌癥)具有很強的保護作用[1, 2, 17]。但RSV對第1次小卒中或TIA發(fā)作后第2次腦卒中發(fā)作有無神經(jīng)保護作用尚未見報道。AMPK是細胞內(nèi)代謝傳感器，能感知細胞內(nèi)ATP∶ADP和ATP∶AMP的比值[18]。在缺血或缺氧的情況下，線粒體迅速停止產(chǎn)生ATP，AMP∶ATP的比值增加，從而促進AMPK的激活[19]。激活的AMPK可以促進細胞能量的產(chǎn)生和線粒體功能的發(fā)揮[20]。SIRT1是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的去乙酰化酶，NAD+是細胞呼吸和糖酵解所必需的關(guān)鍵代謝輔助因子,SIRT1催化NAD+生成煙酰胺。已研究表明SIRT1通過可增加Nrf 2蛋白的表達，提高線粒體抗氧化能力對腦缺血起到神經(jīng)保護作用[21]。本研究旨在探討RSV對復發(fā)大鼠缺血性腦卒中的神經(jīng)保護功能，及其與SIRT1/AMPK信號通路的相關(guān)作用機制。

本研究雙次MCAO較單次MCAO大鼠的梗死體積增大、步態(tài)錯誤和前肢非對稱積分顯著增高，提示雙次MCAO大鼠的大腦皮質(zhì)損害更嚴重。而RSV治療可顯著改善單次和雙次MCAO大鼠的腦梗死體積及神經(jīng)行為功能，說明RSV能夠顯著改善腦缺血導致的大鼠運動-感覺功能障礙，對復發(fā)缺血性腦卒中有顯著的神經(jīng)保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)，RSV對單次MCAO和雙次MCAO的大鼠缺血腦組織的SIRT1表達水平均無影響，但卻顯著提高SIRT1去乙?；钚?起到正性調(diào)節(jié)作用，這可能與RSV作用于SIRT1蛋白的調(diào)節(jié)部位，增強酶的催化活性有關(guān)；也可能是RSV與SIRT1的某些部位結(jié)合使其構(gòu)象發(fā)生改變，這種作用的機制需要進一步研究證實[22]。腦缺血后，缺血腦組織ATP含量降低，RSV可以增加大鼠缺血腦組織的ATP，上調(diào)AMPK磷酸化，從而激活下游PGC1α、MEF2、eNOS等，對缺血區(qū)腦血流的調(diào)節(jié)起保護作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)RSV可改善復發(fā)MCAO大鼠行為功能、縮小腦梗死體積，對大鼠單次和雙次MCAO模型均具有神經(jīng)保護作用，其保護作用與提高SIRT1及AMPK活性和增加腦缺血時能量有關(guān)。同時筆者研究為復發(fā)缺血性腦卒中提供了動物模型，為復發(fā)缺血性腦卒中神經(jīng)保護治療提供新的藥理學途徑奠定基礎。