石潤竹 王 鑫 陳 浩 于江波 董 國 楊樹森

動脈粥樣硬化是冠心病的病理基礎(chǔ)，以血管壁進行性的炎性反應(yīng)導(dǎo)致動脈壁增厚和動脈硬化斑塊的形成[1]。以血管內(nèi)脂質(zhì)、纖維成分堆積、管腔狹窄為主要特征，是多種心血管不良事件的主要原因[2]。慢性炎癥是冠心病的典型標志，該慢性炎性反應(yīng)涉及先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答[3]。其發(fā)病機制一直未能完全闡明。近年來對于動脈粥樣硬化的免疫機制研究取得了很大進展，研究發(fā)現(xiàn)單核-吞噬細胞介導(dǎo)的天然免疫及T細胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答與動脈粥樣硬化關(guān)系密切,調(diào)節(jié)相關(guān)免疫應(yīng)答可能是抑制誘導(dǎo)動脈粥樣硬化斑塊形成及斑塊穩(wěn)定性破壞的炎癥關(guān)鍵,這些因素可能是動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的免疫基礎(chǔ)[4]。

鞭毛蛋白Flic是沙門菌鞭毛的主要成分，作為重要的免疫調(diào)節(jié)劑Flic蛋白有很強的抗原性，參與機體免疫應(yīng)答過程。鞭毛蛋白可以與表達于上皮細胞、單核細胞和未成熟的樹突狀細胞頂端和基底外側(cè)的TLR5受體結(jié)合，觸發(fā)炎性因子和趨化因子分泌，介導(dǎo)激活T細胞和B細胞應(yīng)答[5]。因而被廣泛用作疫苗的佐劑以及治療腸道感染[6]。然而，F(xiàn)lic蛋白發(fā)揮的免疫調(diào)節(jié)作用能否影響動脈粥樣硬化過程尚無報道。因此，本研究對動脈粥樣硬化動物模型注射Flic蛋白，評價Flic蛋白對動脈粥樣硬化的作用及機制，旨在證實Flic蛋白是否可以通過免疫調(diào)節(jié)作用抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。

材料與方法

1.實驗動物分組與建模：選取雄性新西蘭大耳白兔18只，體重2.0～2.5kg，隨機分為3組，即對照組(Con組，n=6)、低剪切力組(LSS組，n=6)、低剪切力+Flic注射組(Flic組，n=6)。Con組不做處理，不予高脂飲食，為空白對照。LSS組采用頸動脈套管聯(lián)合高脂飲食法建立動脈粥樣硬化模型：3%戊巴比妥鈉經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉(30mg/kg)，頸正中切開皮膚表面，鈍性分離動脈周圍組織，暴露右側(cè)頸動脈約2～3cm，使用硅膠套管(長1.0cm、內(nèi)經(jīng)1.5mm、外徑2.0mm)套扎于動脈表面，硅膠管使用手術(shù)縫合線固定，確認套扎頸動脈通暢后，縫合皮膚。術(shù)后第3日開始高脂飲食8周(高脂飲食配制比例為1.5%膽固醇+10.0%豬油+7.5%蛋黃粉+81.0%基礎(chǔ)飼料組成)。Flic組：建立動脈粥樣硬化模型與LSS組相同，術(shù)后第3日開始Flic蛋白100μg皮下注射(GenbankAY353373.1,哈爾濱獸醫(yī)研究所細菌室贈予)，每周1次，共8周。

2.彩色多普勒超聲檢查:分別在實驗開始前(第0周)及第8周后進行彩色多普勒超聲檢查(PHILIPS IE-33)。高頻血管探頭(15MHz)檢查右側(cè)頸動脈。測量右側(cè)頸動脈收縮期峰流速(cm/s)、舒張期峰流速(cm/s)及阻力指數(shù)RI值，觀察套管兩端血管內(nèi)壁有無毛糙、有無動脈粥樣硬化斑塊及斑塊面積(mm2)。

3.血漿IFN-γ和IL-4水平測定:第10周(LSS組及Flic組停用高脂飲食2周后)，采空腹靜脈血，1000×g4℃離心15min，取上清液，應(yīng)用ELISA法檢測血漿IFN-γ和IL-4水平，根據(jù)ELISA試劑盒(上?？道使?說明書操作步驟操作。制作標準曲線后計算IFN-γ和IL-4水平。

4.頸動脈組織形態(tài)學(xué)觀察:第10周(LSS組及Flic組停用高脂飲食2周后)，采用空氣栓塞法處死動物，取套管段近心端5mm范圍內(nèi)頸動脈，10%甲醛固定，石蠟制片，切片，HE染色，光鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化。

結(jié) 果

1.動物情況:第0周及第10周對各實驗組進行稱重，Con組體重由2.28±0.06kg增加到3.10±0.09kg，LSS組體重由2.30±0.04kg增加到3.37±0.07kg，F(xiàn)lic組體重由2.35±0.04kg增加到3.25±0.07kg。3組間動物體重增加值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.超聲評價動脈粥樣硬化:第0周各組管腔無狹窄，無動脈粥樣硬化斑塊。第8周，Con組管腔無狹窄，無動脈粥樣硬化斑塊形成。與Con組比較，F(xiàn)lic組和LSS組動脈血管狹窄程度、阻力指數(shù)RI值及斑塊面積均明顯增加；與LSS組比較，F(xiàn)lic組動脈血管狹窄率、阻力指數(shù)RI值及斑塊面積大小明顯較小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,表1，圖1)。

與Con組比較，*P<0.05;與LSS組比較，#P<0.05

3.HE染色結(jié)果:光鏡下，Con組無明顯動脈粥樣硬化斑塊，內(nèi)膜無增厚。與Con組比較，LSS組血管內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)膜大量平滑肌細胞增殖，內(nèi)有大量泡沫細胞沉積，細胞排列紊亂，斑塊面積明顯增加。與LSS組比較，F(xiàn)lic組血管內(nèi)膜增厚程度及內(nèi)膜平滑肌細胞增殖和泡沫細胞沉積較輕，斑塊面積明顯減小(圖2)。

圖1 各組實驗動物彩超圖像及LSS組和Flic組血管狹窄程度、阻力指數(shù)RI值及斑塊面積A.Con組;B.LSS組;C.Flic組;D.管腔狹窄程度(%);E.阻力指數(shù)RI值;F.斑塊面積(mm2)；與Con組比較，*P<0.05；與LSS組比較，#P<0.05

圖2 HE染色結(jié)果(×10)A.Con組；B.LSS組；C.Flic組;D.斑塊與管腔面積比(%);與Con組比較，*P<0.05;與LSS組比較，#P<0.05

4.血清細胞因子水平結(jié)果:與Con組比較，F(xiàn)lic組和LSS組血清中Th1細胞代表性細胞因子IFN-γ水平明顯升高(P<0.05)，Th2細胞代表性細胞因子IL-4水平明顯降低(P<0.05)，IFN-γ/IL-4比值升高(P<0.05)；與LSS組比較，F(xiàn)lic組Th1細胞代表性細胞因子IFN-γ水平明顯降低(P<0.05)，Th2細胞代表性細胞因子IL-4水平明顯升高(P<0.05)，IFN-γ/IL-4比值明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,表2、圖3)。

表2 各組血清細胞因子水平

與Con組比較,*P<0.05；與LSS組比較，#P<0.05

討 論

圖3 各組實驗動物血清細胞因子的比較A.各組血清細胞因子IFN-γ水平;B.各組血清細胞因子IL-4水平;C.IFN-γ/IL-4;與Con組比較，*P<0.05；與LSS組比較，#P<0.05

動脈粥樣硬化是多因素參與的復(fù)雜病理過程，除高血壓、高血脂、糖尿病、吸煙等傳統(tǒng)危險因素外，剪切力被認為與動脈粥樣硬化關(guān)系同樣密切，其不但能夠決定斑塊的分布位置，更是動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的重要機制之一。壁面剪切應(yīng)力可以調(diào)節(jié)冠狀血管內(nèi)皮功能，血液對血管壁施加的摩擦力可以幫助解釋冠狀動脈粥樣硬化的斑塊發(fā)展[7]。研究證實，湍流形成的低剪切力(<4dynes/cm2)具有促動脈粥樣硬化的作用，層流形成的高剪切力(10～70dynes/cm2)則具有抗動脈粥樣硬化的作用[7]。在冠脈分叉處，由于分叉導(dǎo)致了明顯的速度降低和回流形成降低了剪切應(yīng)力，導(dǎo)致剪切應(yīng)力小于1～2Pa，研究表明，壁面剪切力應(yīng)低于1.2Pa或者震蕩剪切力指數(shù)>0.3的區(qū)域動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生風(fēng)險更大[8]。本研究利用動脈套管法改變血管局部血流狀態(tài)及剪切力大小建立動脈粥樣硬化模型。超聲檢測結(jié)果顯示，與Con組比較，LSS組動脈套管遠心端血管管腔內(nèi)血液呈湍流。高脂飲食8周后，套管遠心端血管管腔狹窄程度、阻力指數(shù)RI值及斑塊面積均明顯增加，提示套管法使局部形成低剪切力進而導(dǎo)致了局部AS的形成。

研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化是一種免疫相關(guān)性疾病，天然免疫和獲得性免疫在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展過程中均起重要作用[1]。動脈粥硬化是一個包含強烈炎性反應(yīng)的復(fù)雜過程，研究顯示巨噬細胞和T細胞的豐富程度與斑塊進展存在正相關(guān)，除降脂之外，抗炎治療對進一步減少心血管事件不可或缺[9]。T細胞是最早被募集并參與動脈粥樣硬化適應(yīng)性免疫應(yīng)答的淋巴細胞。T細胞由多種細胞亞群組成并分泌大量極具功能的細胞因子[2]。IFN-γ作為Th1分泌的代表性細胞因子，具有很強的促動脈粥樣硬化作用。

IFN-γ能夠活化單核-吞噬細胞和樹突狀細胞來維持Th1細胞的促進動脈粥樣硬化效應(yīng)，并可以通過活化這些細胞來抑制血管平滑肌細胞增殖和減少膠原纖維合成，促使纖維帽變薄[2]。表達p-選擇素糖蛋白配體-1(PSGL-1)的CD4 T細胞促進急性冠脈綜合征中斑塊不穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致心血管不良事件發(fā)生[10]。同時，Chen等[11]在研究白細胞計數(shù)與冠狀動脈疾病(CAD)關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，CAD患者細胞毒性T細胞自然殺傷細胞水平顯著降低。最近證據(jù)表明循環(huán)CD4+CXCR5+T細胞可以促進炎性反應(yīng)，導(dǎo)致動脈壁增厚，促進炎性反應(yīng)，CAD患者的CD4+CXCR5+T細胞比正常對照組分泌著更多的IFN-γ、IL-17A、IL-21[1]。

本研究結(jié)果表明，與Con組比較，LSS組細胞因子IFN-γ水平明顯升高，提示Th1細胞活化，參與低剪切力致動脈粥樣硬化過程。Th2在動脈粥樣硬化中的作用具有兩面性，依據(jù)斑塊位置、Th2細胞所處階段及其分泌細胞因子種類和動脈粥樣硬化模型的不同而作用不一。本研究發(fā)現(xiàn)，與Con組比較，LSS組Th2代表性細胞因子IL-4水平明顯降低。提示低剪切力致動脈粥樣硬化過程中，Th2細胞活化參與免疫應(yīng)答。

鞭毛蛋白Flic是一種蛋白性的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)，是沙門菌鞭毛的主要成分，可被TLR5為主的模式識別受體(PRR)識別，作用于表達TLR5的靶細胞，并通過活化MyD88依賴的信號通路，調(diào)控IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-12等促炎細胞因子的合成，上調(diào)協(xié)同刺激分子CD80、CD86以及MHC Ⅱ分子，使抗原遞呈細胞激活和成熟，攝取抗原能力增強，向引流淋巴結(jié)遷移能力增強，從而募集、激活和分化Th細胞，最終啟動獲得性免疫應(yīng)答；亦可通過激活TLR5下游信號通路IRAK-TRAF6復(fù)合體和NF-κB來誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，進而調(diào)節(jié)Th1、Th2、Treg細胞以及IFN-γ、IL-4和IL-12等細胞因子發(fā)揮作用[6]。然而，F(xiàn)lic蛋白能否通過調(diào)控Th1/Th2及相關(guān)細胞因子影響動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展鮮有報道。

本研究發(fā)現(xiàn)，與LSS組比較，F(xiàn)lic組動脈粥樣硬化明顯減輕，Th1細胞代表性細胞因子IFN-γ水平降低，Th2細胞代表性細胞因子IL-4水平升高，IFN-γ/IL-4比值明顯降低。提示Flic蛋白可能通過調(diào)控Th1/Th2抑制低剪切力致動脈粥樣硬化過程。這與以往的研究相類似，Didierlaurent等[12]及Cunningham等[13]研究發(fā)現(xiàn)，重組可溶性Flic蛋白和聚合Flic蛋白均對Th2的分化有強烈的刺激作用。而以往關(guān)于Flic影響Th1的研究結(jié)果卻與本研究不完全相同。McSorley等[14]在小模型研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lic蛋白可以促進OVA323～339特異性Th1型CD4+T細胞的分化。Means等[15]的研究并不支持這些觀點，他們認為Flic蛋白激活人類DCs并不產(chǎn)生IL-12p70，進而對Th1細胞反應(yīng)無明顯影響。相同的情況在動物模型中也有體現(xiàn)，Bobat等[16]研究發(fā)現(xiàn)，重組的Flic蛋白能夠引起小鼠IL-4 mRNA及蛋白表達增加，但對IFN-γ無影響。這些結(jié)論的得出可能模型的選擇，尤其是Flic蛋白種類、應(yīng)用時間和劑量等因素有關(guān)。

近年來，關(guān)于Flic蛋白通過調(diào)節(jié)細胞和體液免疫影響動脈粥樣硬化的研究正逐漸成為熱點。雖然多項研究中Flic蛋白對動脈粥樣硬化的影響不盡相同，具體作用與機制還有待于進一步驗證與闡明，但“以菌治病”將可能成為抗動脈粥樣硬化治療的新方向。