胡昭君 李冬梅 杜華英 ，2 杜 娟 ，2 熊建華 ，2*

（1江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 南昌 330045

2南昌市農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 330045）

亞硝酸鹽廣泛存在于人們的日常生活中，蔬菜、千滾水、火鍋等都含有亞硝酸鹽[1]。在肉制品加工過程中，亞硝酸鹽不僅會自然富集，而且常作為發(fā)色劑和防腐劑添加到肉制品中[2]。過量的亞硝酸鹽可使人體中毒[3]，亞硝酸鹽可與人體中的胺類物質(zhì)反應(yīng)生成強(qiáng)致癌物亞硝胺，導(dǎo)致人類罹患胃癌、肝癌等癌癥[4]。我國對食品中亞硝酸鹽含量提出了明確的限量標(biāo)準(zhǔn)[5]。研究可清除食品中亞硝酸鹽，抑制亞硝胺合成的亞硝化反應(yīng)因素具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)含有VC、黃酮類、酚類等植物提取物具有一定的清除亞硝酸鹽能力[6]。綠原酸類物質(zhì)屬酚類化合物，分為3-O-咖啡?？鼘幩?（綠原酸）、4-O-咖啡?？鼘幩帷?-O-咖啡?？鼘幩帷?，4-二咖啡酰奎寧酸、3,5-二咖啡?？鼘幩幔ó惥G原酸 A ）、4，5-二咖啡酰奎寧酸、3-，4-，5-阿魏?？鼘幩岬?，不僅存在于忍冬科、杜仲科、菊科等藥食兩用植物中，在水果、蔬菜及茶葉等食品中也有一定含量[7-8]，具有抗癌、抗氧化、降糖降脂、抗菌抗病毒等多種藥理功能[9-11]，常添加到食品、藥品、化妝品中以增加食品的保質(zhì)期、利用率和更好地治療疾病、護(hù)理皮膚[12-13]。本文以抗壞血酸和蘆丁作為參照品，研究綠原酸、異綠原酸A清除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺合成的抑制亞硝化反應(yīng)能力及條件，為清除亞硝酸鹽，阻斷亞硝胺合成提供天然安全途徑。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑：異綠原酸A（≥99%）、亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品、1-萘胺，Aladdin Chemistry Co.Ltd；綠原酸、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品鑒定所；二甲胺40%水溶液，天津市大茂化學(xué)試劑廠；無水對氨基苯磺酸，上海三愛思試劑有限公司；N-1-萘乙二胺鹽酸鹽，天津市福晨化學(xué)試劑廠。

主要儀器：SpectraMax M2酶標(biāo)儀，Molecular Devices公司；UV-9100紫外-可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；移液器，Thermos；PHS-3C pH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 最佳檢測波長的確定 準(zhǔn)確吸取已配制的5 μg/mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液2 mL于25 mL容量瓶中，加入pH 3.4的檸檬酸（0.1 mol/L）-磷酸氫二鈉（0.2 mol/L）緩沖溶液18.75 mL，37℃水浴30 min后取出，加入0.4%對氨基苯磺酸溶液2 mL，混勻靜置3 min，加入1 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，用蒸餾水稀釋至25 mL，混勻放置15 min，用重蒸餾水代替亞硝酸鈉溶液，以相同配制方法處理的溶液作參比，用紫外-可見分光光度計在波長400～800 nm范圍進(jìn)行掃描，確定最大吸收波長λmax。

1.2.2 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 參照謝文仙等[14]方法并稍作改動。 分別吸取 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 μg/mL 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液 16 μL 于酶標(biāo)板的微孔中，加入pH 3.4的檸檬酸（0.1 mol/L）-磷酸氫二鈉（0.2 mol/L）緩沖溶液 150 μL，37 ℃水浴12 min后取出，立即加入0.4%對氨基苯磺酸16 μL，混勻后靜置 5 min，加入 8 μL 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，用重蒸餾水稀釋至200 μL，混勻后靜置15 min。在確定的最大吸收波長處測定吸光度（AX），同時做空白試驗(yàn)（A0）。 每個處理重復(fù) 3次，計算平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 綠原酸清除亞硝酸鹽的研究

1.2.3.1 不同濃度時清除亞硝酸鹽的效果 配制質(zhì)量濃度為 0.5，1，2，3，4，5，6，7，8 μg/μL 的綠原酸、異綠原酸A、VC、蘆丁等溶液，分別吸取上述溶液 10 μL 于酶標(biāo)板的微孔中，加入 16 μL 5 μg/mL亞硝酸鈉溶液，再加入pH 3.4的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液150 μL，在37℃水浴30 min后取出，立即加入0.4%對氨基苯磺酸16 μL，混勻后靜置5 min，加入8 μL 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，混勻后靜置15 min，在確定的最大吸收波長處測定吸光度（AXX），同時用蒸餾水代替樣品做空白試驗(yàn)（AX0），計算清除率并繪制變化圖。

1.2.3.2 不同pH值時清除亞硝酸鹽的效果 分別吸取上述試驗(yàn)得到的最佳濃度的綠原酸、異綠原酸A、VC、蘆丁溶液各10 μL于酶標(biāo)板的微孔中，分別加入16 μL 5 μg/mL亞硝酸鈉溶液和pH值分別為 2.8，3.4，4.0，4.6，5.2，5.8 的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液150 μL，然后于37℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，按照同上操作加入試劑，測定吸光度，計算清除率并繪制亞硝酸鹽清除率變化圖。

1.2.3.3 不同反應(yīng)時間時清除亞硝酸鹽的效果 依據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，準(zhǔn)確吸取10 μL最佳濃度的綠原酸溶液、異綠原酸A溶液、VC溶液、蘆丁溶液于酶標(biāo)板的微孔中，再加16 μL 5 μg/mL亞硝酸鈉溶液和150 μL最佳pH的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液于酶標(biāo)的微孔中，分別置于溫度37℃的水浴鍋中，反應(yīng) 5，10，20，30，40，50 min 后取出，加入0.4%對氨基苯磺酸16 μL，反應(yīng)5 min，加入8 μL 0.2% 鹽酸萘乙二胺溶液，混勻后靜置15 min。在確定的最大吸收波長處測定吸光度，計算亞硝酸鹽清除率并繪制變化圖。

1.2.3.4 不同溫度時清除亞硝酸鹽的效果 添加10 μL最佳濃度綠原酸等溶液于酶標(biāo)板的微孔中，加入16 μL 5 μg/mL亞硝酸鈉溶液和最佳pH值的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液150 μL，置于溫度分別為 4，17，27，37，47，57 ℃的水浴鍋中，反應(yīng)一定時間后取出，加入試劑進(jìn)行顯示反應(yīng)并測定吸光度，計算亞硝酸鹽清除率并繪制變化圖。

1.2.4 綠原酸阻斷亞硝胺合成的研究

1.2.4.1 不同濃度對阻斷亞硝胺合成的影響 準(zhǔn)確配制 0.5，1，2，3，4，5 μg/μL 等不同濃度的綠原酸、異綠原酸A、VC、蘆丁溶液，分別吸取上述溶液10 μL于洗凈的離心管中，10 mmol/L亞硝酸鈉溶液、10 mmol/L二甲胺溶液各8 μL，加入pH 3.4的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液至200 μL，在37℃下水浴30 min。準(zhǔn)確吸取反應(yīng)液8 μL于酶標(biāo)板的微孔中，加入0.5%碳酸鈉溶液4 μL，在紫外-可見分光光度儀（選定波長254 nm）上照1 h。取出后加入1%對氨基苯磺酸12 μL，混勻靜置3 min，再加入 0.1% α-萘胺 12 μL、蒸餾水 4 μL，混勻靜置30 min。在確定的最大吸收波長510 nm處測定吸光度（AYX），平行試驗(yàn)3次，求平均值。同時做空白對照試驗(yàn)（AY0），計算亞硝酸胺合成阻斷率并繪制變化圖。

1.2.4.2 不同pH值對阻斷亞硝胺合成的影響配制 pH 值分別為 2.2，2.8，3.4，4.0，4.6，5.2，5.8 的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，根據(jù)1.2.4.1節(jié)的試驗(yàn)結(jié)果，分別吸取最佳濃度的4種溶液10 μL、8 μL 10 mmol/L亞硝酸鈉和10 mmol/L二甲胺溶液于洗凈的0.5 mL離心管中，加入不同pH緩沖液至200 μL，于37℃水浴鍋中水浴30 min，按照同1.2.4.1節(jié)步驟，加入試劑進(jìn)行反應(yīng)，并測定吸光度，計算亞硝酸胺合成阻斷率并繪制變化圖。

1.2.4.3 不同反應(yīng)時間阻斷亞硝胺合成的效果根據(jù)以上試驗(yàn)的結(jié)果，準(zhǔn)確吸取10 μL最佳濃度的4種物質(zhì)，10 mmol/L亞硝酸鈉溶液和10 mmol/L二甲胺溶液各8 μL于離心管中，加最佳pH值緩沖液至200 μL，于溫度37℃的水浴鍋中分別反應(yīng) 1，3，5，10，20，30 min 后取出，按照同上操作測定吸光度值，計算亞硝酸胺合成阻斷率并繪制變化圖。

1.2.4.4 不同溫度時阻斷亞硝胺合成的效果 在以上試驗(yàn)基礎(chǔ)上，取最佳濃度綠原酸、異綠原酸A、VC、蘆丁溶液 10 μL，8 μL 10 mmol/L 亞硝酸鈉溶液和10 mmol/L二甲胺溶液于離心管中，加最佳pH緩沖液至200 μL，置于溫度分別為4，17，27，37，47，57℃的水浴鍋中反應(yīng)最適時間后，按同上步驟測定吸光度值，計算亞硝酸胺合成阻斷率并繪制變化圖。

1.2.5 抑制亞硝化條件優(yōu)選 根據(jù)綠原酸類物質(zhì)清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的最適條件與變化規(guī)律優(yōu)選抑制亞硝化條件并做驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.2.6 亞硝酸鹽清除率和亞硝胺合成阻斷率的統(tǒng)計 以上每個試驗(yàn)重復(fù)3次，同時做空白對照試驗(yàn)，按照公式1和公式2進(jìn)行亞硝酸鹽清除率和亞硝酸胺合成阻斷率的計算，并根據(jù)結(jié)果繪制各變化圖。

圖1 吸收波長曲線Fig.1 The curve of absorption wavelength

式中，AX0——未加樣液時的吸光度值；AXX——加樣液時的吸光度值。

式中，AY0——未加樣液時的吸光度值；AYX——加樣液時的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 最大測定波長

由圖1可知，亞硝酸鈉反應(yīng)液的最大吸收波長為526 nm。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以亞硝酸鈉濃度為橫坐標(biāo)，以測定的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸處理，得到回歸方程y=0.125x+0.016，R2=0.998，說明在本試驗(yàn)條件下，亞硝酸鈉溶液在0.5～6.0 μg/μL質(zhì)量濃度范圍線性關(guān)系良好?？梢酝ㄟ^吸光度來計算樣品中亞硝酸鹽的濃度。

圖2 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Standard curve of sodium nitrite

2.3 清除亞硝酸鹽的研究

2.3.1 各物質(zhì)濃度對亞硝酸鹽清除率的影響 綠原酸等物質(zhì)濃度對亞硝酸鹽的清除作用如圖3所示。綠原酸對亞硝酸鹽的清除率隨濃度的增加而升高，當(dāng)質(zhì)量濃度為5 μg/μL時對亞硝酸鹽的清除率逐漸穩(wěn)定，此時的清除率為57.34%；異綠原酸A清除亞硝酸鹽的作用較綠原酸好，當(dāng)質(zhì)量濃度為4 μg/μL時清除率達(dá)59.83%，濃度繼續(xù)增大清除效果增加漸緩；蘆丁和VC在低濃度時效果介于異綠原酸A與綠原酸之間，質(zhì)量濃度大于5 μg/μL時清除效果好于異綠原酸A，當(dāng)質(zhì)量濃度為7 μg/μL時清除率增加變緩，此時蘆丁和VC清除率分別為 69.03%，72.41%。5 μg/μL 時樣品和對照品清除效果相差較小，選擇5 μg/μL質(zhì)量濃度做下一步試驗(yàn)。

2.3.2 pH值對亞硝酸鹽清除率的影響 綠原酸類物質(zhì)隨pH值變化對亞硝酸鹽的清除率的試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。pH值對各物質(zhì)清除亞硝酸鹽的影響較大，4種物質(zhì)隨pH值的增大其清除率降低，其中綠原酸、VC隨pH值升高降低較緩慢，可在較大的范圍內(nèi)保持較好的活性。綠原酸pH 3.4時對亞硝酸鹽的清除率為57.44%，pH 4.0時清除率保持在53.97%。VC在pH 3.4時對亞硝酸鹽的清除率為60.49%，pH 4.0時清除率保持在58.00%。異綠原酸A隨pH值的升高快速降低，蘆丁隨pH值的增大先緩慢下降后快速降低。pH值通過影響綠原酸等物質(zhì)中羥基的解離形式，進(jìn)而影響綠原酸等物質(zhì)與亞硝酸鹽反應(yīng)，尤其異綠原酸A分子中含有更多的羥基，對pH值的變化更敏感。在所選pH范圍，蘆丁和VC的清除效果好于綠原酸和異綠原酸A，而在pH 2.8和3.4時4種物質(zhì)的清除效果相差不大，都比較好；pH 2.8～3.4時與人體胃液酸度比較接近，綠原酸能在其中保持較好的活性，可清除胃中的亞硝酸鹽，減少人體因亞硝酸鹽過量引起的中毒等不良反應(yīng)的發(fā)生。pH 3.4的酸性較緩和，選擇pH 3.4作為下一步試驗(yàn)的pH。

2.3.3 反應(yīng)時間對亞硝酸鹽清除率的影響 反應(yīng)時間對綠原酸類物質(zhì)清除亞硝酸鹽的影響見圖5。4種物質(zhì)都隨時間的增加對亞硝酸鹽的清除作用增強(qiáng)。其中綠原酸、異綠原酸A和蘆丁變化規(guī)律較為一致，都先快速增加后緩慢增加，40 min時的清除率分別為61.43%，67.44%，70.73%；當(dāng)反應(yīng)時間小于20 min時VC的作用效果小于綠原酸，隨著作用時間的增長，其作用效果稍強(qiáng)于綠原酸，40 min時的清除率為64.25%。40 min后4種物質(zhì)的清除率都增加緩慢，再延長反應(yīng)時間意義不大。最終選擇40 min做下一步試驗(yàn)。

圖3 各物質(zhì)濃度對亞硝酸鹽清除率的影響Fig.3 Effect of different concentrations on the rate of cavenging nitrite

2.3.4 溫度對亞硝酸鹽清除率的影響 綠原酸等物質(zhì)隨溫度的變化對亞硝酸鹽的清除率的試驗(yàn)結(jié)果見圖6。4種物質(zhì)隨溫度的增大對亞硝酸鹽的清除作用增大；在低溫時4種物質(zhì)的清除作用相差較大，隨著溫度的升高，物質(zhì)間的清除率差距減?。?7℃時4種物質(zhì)間的差距最小，此時綠原酸和異綠原酸A的清除率分別為79.69%和78.15%；57℃時各物質(zhì)的清除率增加較小。相對于高溫，47℃更易保存食品的理化品質(zhì)。最終選擇47℃作為反應(yīng)溫度。

綠原酸、異綠原酸A清除亞硝酸鹽的效果較好，總體而言，異綠原酸A好于VC，綠原酸與VC相近，兩者清除效果略低于蘆丁。清除作用與體系溫度、pH值、反應(yīng)時間等各種因素有關(guān)。5 μg/μL綠原酸和異綠原酸A在pH 3.4，溫度47℃的條件下作用40 min，可清除79.69%和78.15%的亞硝酸鹽。

2.4 阻斷亞硝胺合成的研究

2.4.1 不同濃度綠原酸類物質(zhì)對亞硝胺合成阻斷率的影響 胃中的胺類物質(zhì)可與亞硝酸鹽反應(yīng)生成強(qiáng)致癌物亞硝胺，消除亞硝酸鹽可在一定程度上阻斷亞硝胺的生成，然而亞硝胺的形成受溫度、pH等因素的影響。本試驗(yàn)以VC和蘆丁為參照，研究綠原酸類物質(zhì)在不同條件下對亞硝胺合成的阻斷效果。添加不同濃度的綠原酸類物質(zhì)影響亞硝胺合成阻斷率的試驗(yàn)結(jié)果。如圖7所示，各物質(zhì)對亞硝胺合成的阻斷率隨濃度的增大先快速升高后緩慢升高，綠原酸和VC的阻斷效果較為接近，當(dāng)質(zhì)量濃度為3 μg/μL時阻斷率分別為48.49%，50.86%；異綠原酸A阻斷效果好于VC，當(dāng)質(zhì)量濃度為3 μg/μL時阻斷率達(dá)60.96%；蘆丁阻斷效果最好，質(zhì)量濃度為1 μg/μL時阻斷率就達(dá)68.75%；4種物質(zhì)在質(zhì)量濃度大于3 μg/μL后雖有上升，但上升程度小，故選擇3 μg/μL進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖4 不同pH值對亞硝酸鹽清除率的影響Fig.4 Effect of different pH on the rate of cavenging nitrite

圖5 不同反應(yīng)時間對亞硝酸鹽清除率的影響Fig.5 Effect of different action time on the rate of cavenging nitrite

圖6 不同溫度對亞硝酸鹽清除率的影響Fig.6 Effect of different temperature on the rate of cavenging nitrite

2.4.2 pH值對亞硝胺合成阻斷率的影響 綠原酸等物質(zhì)在不同pH值條件下對亞硝胺合成的阻斷效果見圖8。隨著pH值的增大，4種物質(zhì)的阻斷率降低。在試驗(yàn)的pH范圍內(nèi)4種物質(zhì)中蘆丁的阻斷率高，其次為異綠原酸A，綠原酸和VC的阻斷效果不及異綠原酸A。當(dāng)pH值為2.8時綠原酸、異綠原酸A、VC、蘆丁4種物質(zhì)相較于pH 3.4具有較好的阻斷亞硝胺合成的作用，阻斷率分別為 60.89%，68.46%，63.28%，76.57%。 最終選擇pH 2.8做下步試驗(yàn)。

圖7 不同濃度綠原酸類物質(zhì)對亞硝胺合成阻斷率的影響Fig.7 Effect of different concentration chlorogenic acids on the rate of blocking synthesis of nitrosamine

2.4.3 反應(yīng)時間對亞硝胺合成阻斷率的影響 圖9顯示不同時間4物質(zhì)阻斷亞硝胺合成的效果。隨著時間的增加，各物質(zhì)對亞硝胺合成的阻斷率先快速增加，尤其在5 min前，20 min后增加趨勢不明顯，最終選擇20 min為最佳的反應(yīng)時間。阻斷效果排序?yàn)樘J丁、異綠原酸A、VC、綠原酸，這4種物質(zhì)在5 min的阻斷率分別為72.79%，58.39%，49.91%，44.72%，20min時的阻斷率分別為76.29%，64.99%，60.53%，58.04%。

2.4.4 溫度對亞硝胺合成阻斷率的影響 不同溫度下各種物質(zhì)阻斷亞硝胺合成的效果見圖10。蘆丁、異綠原酸A、VC、綠原酸的阻斷率都隨溫度的升高而逐漸增加，各物質(zhì)在47℃時阻斷率較為接近，分別為 77.43%，68.31%，67.09%，70.93%，此時綠原酸的阻斷率強(qiáng)于異綠原酸A和VC?？梢姕囟葘G原酸阻斷亞硝胺合成有較為顯著的促進(jìn)作用。57℃時綠原酸等物質(zhì)的阻斷率上升不顯著，47℃為合適的反應(yīng)溫度。

總體而言，對亞硝胺合成合成反應(yīng)阻斷效果：蘆丁最好，異綠原酸其次，綠原酸與VC相近。

圖8 不同pH對亞硝胺合成阻斷率的影響Fig.8 Effect of different pH on the rate of blocking synthesis of nitrosamine

圖9 不同反應(yīng)時間對亞硝胺合成阻斷率的影響Fig.9 Effect of different action time on the rate of blocking synthesis of nitrosamine

圖10 不同溫度對亞硝胺合成阻斷率的影響Fig.10 Effect of different temperature on the rate of blocking synthesis of nitrosamine

2.5 抑制亞硝化反應(yīng)的研究

綠原酸、異綠原酸A清除亞硝酸鹽的最適濃度、pH、反應(yīng)時間、 溫度分別為 5 μg/μL，3.4，40 min和47℃，阻斷亞硝胺合成合成的最適濃度、pH、 反應(yīng)時間和溫度分別為 3 μg/μL，2.8，20 min及47℃，且抑制亞硝化反應(yīng)效果變化趨勢一致，均隨濃度、反應(yīng)時間和溫度的升高逐漸增強(qiáng)，隨pH的升高而降低。最終選擇抑制亞硝化反應(yīng)條件樣品濃度 5 μg/μL、pH 2.8、反應(yīng)時間 40 min、溫度47℃并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)（表1）。

表1 4種物質(zhì)對清除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺合成的效果Table1 Effect of four substances on cavenging nitrite and synthesis of nitrosamine

所選反應(yīng)條件下綠原酸和異綠原酸A的亞硝酸鹽的清除率在80%以上，亞硝胺合成阻斷率在70%以上，均有較好的抑制亞硝化效果。

綠原酸和異綠原酸A都有較好的抑制亞硝化反應(yīng)的能力，隨反應(yīng)體系環(huán)境的變化而存在差異。

3 結(jié)論

綠原酸類物質(zhì)清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的抑制亞硝化效果隨濃度、反應(yīng)時間和溫度的升高逐漸增強(qiáng)，隨pH值的升高而降低。清除亞硝酸鹽的最適質(zhì)量濃度 5 μg/μL，pH 3.4，反應(yīng)時間40 min，溫度47℃；阻斷亞硝胺合成的最適質(zhì)量濃度 3 μg/μL，pH 2.8，反應(yīng)時間 20 min 和溫度 47℃；抑制亞硝化反應(yīng)最適條件為質(zhì)量濃度5 μg/μL、pH 2.8、反應(yīng)時間 40 min、溫度 47℃。 在抑制亞硝化反應(yīng)方面，綠原酸與VC效果相當(dāng)，稍弱于異綠原酸A，三者效果弱于蘆丁。