潘 蘭, 石明輝, 夏提古麗·阿不利孜, 賈新岳

(新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所,新疆烏魯木齊830002)

維吾爾藥烏斯乃為松蘿科松蘿屬植物節(jié)松蘿Usnea diffracta Vain.的干燥全草,性平和,具有收斂營養(yǎng)力、消散淤結(jié)、爽身強(qiáng)心、調(diào)經(jīng)助陽的功效,用于久瀉、久咳、心悸氣短、癲癇、神失、心煩陽弱、嘔惡氣喘、月事不調(diào)、毒蛇咬傷［1］。前期課題組在市場調(diào)查中發(fā)現(xiàn),烏斯乃使用的藥材各異,來源復(fù)雜,作為《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn) 維吾爾藥分冊》 收載品種,標(biāo)準(zhǔn)中僅有“理化鑒別” 項(xiàng)［2］,難以判斷藥材的真?zhèn)?保證其入藥的準(zhǔn)確性及臨床的有效性。

本研究對烏斯乃的市場流通及臨床應(yīng)用情況進(jìn)行調(diào)查,并建立烏斯乃及其替代品、易混淆品的HPLC 鑒別方法。該方法快速、簡便、專屬性強(qiáng),可為該藥材的準(zhǔn)確、安全使用及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

烏斯乃及其替代品、易混淆品(圖1) 收集于新疆和田維吾爾市場、甘肅藥材市場,經(jīng)中國科學(xué)院微生物研究所真菌學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室郭守玉研究員鑒定,憑證標(biāo)本存放于新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所。

松蘿酸、黑茶漬素為實(shí)驗(yàn)室自制 (結(jié)構(gòu)經(jīng)1H-NMR、13C-NMR、MS 等波譜技術(shù)鑒定),HPLC 法測定其含有量均大于99%。微孔濾膜(0.22 μm,天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。HPLC 所用試劑均為色譜純；水為超純水。

Waters2695 高效液相色譜儀 (美國Waters 公司)；PDA2998 檢測器(美國Waters 公司)；Shimpack PREP-ODS(HKIT) C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,日本島津公司)；AB265-S 電子天平 (瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ5200DB 超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

2 方法

2.1 市場流通使用情況了解 走訪調(diào)查,以及對資深專業(yè)人士的訪談。

2.2 HPLC 鑒別

2.2.1 色譜條件 Shimpack PREP-ODS(HKIT)C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相甲醇-1%乙酸(79 ∶21)；柱溫30 ℃；檢測波長285 nm；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 供試品溶液制備 取樣品約0.1 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加入乙酸乙酯50 mL,密塞,稱定質(zhì)量,超聲(200 W、40 kHz) 提取40 min,取出,放冷,再稱定質(zhì)量,乙酸乙酯補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.2.3 HPLC 圖譜建立 精密吸取各供試品溶液10 μL,注入高效液相色譜儀,在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣。對不同供試品HPLC 色譜圖的峰數(shù)、峰面積、相對保留時間等參數(shù)進(jìn)行比較,優(yōu)化圖譜。

2.3 相似度分析 將樣品色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004 年A 版) ” 軟件,分析相似度。

3 結(jié)果

3.1 烏斯乃替代品、易混淆品 課題組對各地維吾爾藥材市場及維吾爾醫(yī)院的調(diào)查發(fā)現(xiàn),烏斯乃替代品、易混淆品常見的有梅衣屬植物槽梅衣Parmelia sulcata,條衣屬植物條衣Everniastrum cirrhatum、中華金絲Lethariella sinensis 和長松蘿Usnea longissima。

3.1.1 槽梅衣［3］隸屬于梅衣科梅衣屬地衣,葉狀,上表面礦灰色,有光澤,下表面黑色,具有假根,致密,富分枝；髓白色；分生孢子器不發(fā)達(dá)；子囊盤表面生,罕見。主要生長在巖石或樹皮上,分布于新疆等地。

圖1 各樣品照片

3.1.2 條衣［4］隸屬于梅衣科條衣屬葉狀地衣,上表面淺灰至灰色,下表面黑色；裂片邊緣整齊,稍向內(nèi)卷,有時成溝狀,裂片深裂成條帶狀,形成二叉狀分枝,髓白色,邊緣常有纖毛或假根。主要生長在松樹或其他灌木的枯枝上,分布于云南、河北等地。

3.1.3 中華金絲［5］梅衣科金絲屬地衣,具有真菌和藻類共生形成的特殊復(fù)合生物,多年生,枯草黃至黃綠色；絲體呈圓柱形或扁圓形,絲狀體表面呈網(wǎng)狀棱脊,基部污白色,向上漸次赭黃或桔黃色,無光澤,稍卷曲,頂端漸尖,無粉芽,子囊盤及分生孢子器。主要生長在高海拔雪山地帶的松樹枯枝上,分布于西藏、云南、四川等地。

3.1.4 長松蘿［6-7］松蘿科松蘿屬枝狀地衣,灰綠色,成線狀,下垂,長可達(dá)100 cm。外皮粗松,中心堅(jiān)密。子器稀少,皿狀,生于枝的先端。主要生長在松樹或其他樹的樹皮上,分布于東北、陜西、安徽、浙江、廣東、云南、西藏等地。

3.2 HPLC 鑒別

3.2.1 方法學(xué)考察

3.2.1.1 空白試驗(yàn) 精密吸取空白溶液10 μL,注入高效液相色譜儀,結(jié)果表明空白不干擾測定。

3.2.1.2 精密度試驗(yàn) 同一供試品溶液在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣7 次,測得主要色譜峰面積及保留時間RSD 為0.30%,表明儀器精密度良好。

3.2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同批藥材6 份,按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,測得主要色譜峰面積及保留時間RSD 為0.96%,表明該方法重復(fù)性良好。

3.2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液,分別于0、1、2、4、6、12、24 h 在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,測得主要色譜峰面積及保留時間RSD 為0.47%,表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2.2 HPLC 特征圖譜比較 烏斯乃及其替代品、易混淆品的HPLC 圖譜見圖2,包括色譜峰數(shù)、相對保留時間、色譜峰峰面積及比例,可直觀地發(fā)現(xiàn)烏斯乃及其替代品、易混淆品上述指標(biāo)差異很大。以烏斯乃正品為對照,利用相似度軟件進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)替代品、易混淆品與其相似度很低,條衣、 中華金絲、 槽梅衣、 長松蘿分別為0.003、0.004、0.003、0.001。

由HPLC 色譜圖可知,在30 min 內(nèi)條衣有16 個特征色譜峰, 其中易于辨識的有9 個, 最具特征性的在11.263 min處,峰形大；中華金絲有7 個分離度較好的色譜峰, 18.620、 24.068 min 處為其特征峰, 黑茶漬素(24.068 min) 所占比例為59.90%；烏斯乃有10 個色譜峰,13.301、19.376、21.669 min 處為其特征峰,且三者含有量達(dá)90%；槽梅衣有9 個特征峰,主要集中于11 min前,其中5.208 min 處所占比例達(dá)80%；長松蘿有9 個特征峰, 以10.934、 18.950 min (松蘿酸) 為主, 兩者占99.75%。

4 討論與結(jié)論

課題組在甘肅、新疆、四川、東北等地的調(diào)查發(fā)現(xiàn),烏斯乃野生資源非常少,僅在黑龍江紅星林場中生長,蘊(yùn)藏量極低。目前,藥材市場上未見有節(jié)松蘿出售,現(xiàn)新疆維吾爾醫(yī)院及藥材市場用的烏斯乃主要是槽梅衣和條衣。據(jù)《中華本草》 (維吾爾藥卷) 記載,長松蘿也是烏斯乃藥材的來源之一,隨著用藥的規(guī)范化,新疆維吾爾藥廠現(xiàn)在用的基本為該品種。中華金絲由于形態(tài)和節(jié)松蘿有諸多的相似之處,一直誤作為節(jié)松蘿使用和出售,基于此,課題組發(fā)現(xiàn)烏斯乃用藥問題存在相當(dāng)長一段時間,直接影響了藥物有效性和臨床安全性,對于這些藥物是否可以代替烏斯乃入藥還需要進(jìn)一步的證實(shí)。

圖2 各樣品HPLC 色譜圖

烏斯乃常見替代品、易混淆品為梅衣屬、松蘿屬植物,松蘿屬植物以縮酚類、二苯并呋喃類、蒽醌類等成分為主,但是均含有松蘿酸［6］；梅衣屬植物主要含有黑茶漬素、藻紋苔酸、protocetraric 等成分［8］；條衣屬植物含有生物堿、皂苷、鞣質(zhì)類［9］。金絲屬植物主要含有一些色素類物質(zhì)［10］(canarione、1,2-quinone derivatives、rubrocashmeriquinone、7-chlororubrocashmeriquinone、 7-chlorocanarione)。 由 此 可見,烏斯乃與其替代品、易混淆品化學(xué)成分的差異較大,因此可用HPLC 法進(jìn)行鑒別。

本實(shí)驗(yàn)建立了烏斯乃HPLC 圖譜,與市場上常用的替代品、混淆品相比,其共有峰數(shù)差異明顯,表明化學(xué)成分存在較大區(qū)別,它們能否應(yīng)用于臨床還需進(jìn)一步研究。

同時,該方法基線穩(wěn)定,易于操作,重復(fù)性好,能有效地區(qū)分烏斯乃及其替代品、易混淆品,可為該藥材的鑒別及質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。