柯于培, 秦一雨, 舒 濤*

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院,遼寧 錦州121000；2.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院博士后創(chuàng)新實(shí)踐基地,江蘇鹽城224005)

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,在我國消化道惡性腫瘤發(fā)病率中排第二位,發(fā)病率逐年升高［1］。近年來隨著外科手術(shù)和腫瘤治療方案發(fā)展,結(jié)腸癌患者生存期和生存率在一定程度上得到了改善,但對(duì)于部分在確診時(shí)已處于中晚期的患者來說,大多數(shù)已經(jīng)喪失根治性手術(shù)的機(jī)會(huì),即使手術(shù)切除后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的概率也很高。研究表明,晚期結(jié)腸癌,尤其是合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者總體中位生存期不超過20 個(gè)月［2］。由于目前臨床上對(duì)該類患者以化療為主,故探索新型有效的化療策略對(duì)于提高療效至關(guān)重要。

近年來,中醫(yī)藥在腫瘤治療中的作用逐漸受到重視,一方面患者在手術(shù)后可通過中醫(yī)藥干預(yù)來扶助正氣,促進(jìn)術(shù)后快速恢復(fù),預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)；另一方面,對(duì)于一些中晚期患者可采用放化療聯(lián)合中醫(yī)藥治療策略來發(fā)揮協(xié)同抗癌或增效減毒作用,延長生存期,改善生存質(zhì)量［3-4］。青蒿素是黃蒿中的一種活性成分,屠呦呦教授因發(fā)現(xiàn)其抗瘧功效而獲得諾貝爾生理/醫(yī)學(xué)獎(jiǎng),近年來研究發(fā)現(xiàn),青蒿素除了抗瘧活性外還具有廣泛的藥理活性,如在體內(nèi)或體外可抑制多種腫瘤(如白血病、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌等) 的生長和發(fā)展［5-10］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),青蒿素能抑制膽囊癌細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［11］；本實(shí)驗(yàn)將青蒿素、吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用于結(jié)腸癌細(xì)胞株LOVO、HT29,觀察兩者對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響,并初步探討其分子機(jī)制,為開拓臨床治療結(jié)腸癌用藥新方案提供理論依據(jù)。

1 材料

人結(jié)腸癌細(xì)胞株(LOVO、HT29) 購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫；人結(jié)腸上皮細(xì)胞FTC 購自美國ATCC 細(xì)胞庫；青蒿素、青鏈霉素購自美國Sigma 公司；吉西他濱購自美國Eli Lilly 公司；DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液購自美國Gibco 公司；胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Hyclone 公司；Annexin V-FITC 試劑盒購自美國BD 公司；WST-1、JC-1、蛋白提取試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PVDF 膜 購 自 美 國Millipore 公 司； 抗p-ERK1/2、 BAX、BCL-2、Caspase-3、細(xì)胞色素C 一抗以及二抗購自美國Santa Cruz 生物公司；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司；X-OMAT-Blue film 購自美國Kodak 公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) LOVO、HT29、FTC 細(xì)胞均采用含10%胎牛血清、1 mmol/L 非必需氨基酸、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)在5%CO2、37 ℃條件下的培養(yǎng)箱中,均為貼壁細(xì)胞,每天換液,2 ～6 d 傳代一次。當(dāng)細(xì)胞匯合程度達(dá)80%時(shí),0.25%胰蛋白酶消化傳代,繼續(xù)按上述方法培養(yǎng)。

2.2 Western blot 檢測青蒿素對(duì)p-ERK1/2、bax、bcl-2 等蛋白在LOVO、HT29 細(xì)胞中表達(dá)水平的影響。根據(jù)蛋白提取試劑盒說明書操作提取細(xì)胞漿蛋白和線粒體蛋白,Bradford 法測定各樣本中蛋白含有量,95 ℃水浴變性5 min后,將30 μg 蛋白樣品加到SDS-PAGE 膠中進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜(0.2 μmol/L PVDF 膜),印記膜用脫脂奶粉封閉,分別加入目的單克隆一抗(1 μg/mL) 在4 ℃下孵育過夜,再加入二抗(0.2～0.5 μg/mL) 在常溫下孵育2 h,ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒對(duì)HRP 信號(hào)進(jìn)行檢測,X 光片曝光顯影。βactin 蛋白作為內(nèi)參。

2.3 WST-1 取對(duì)數(shù)生長期LOVO、HT29 細(xì)胞接種于96孔板中,細(xì)胞密度約為5×103/孔,細(xì)胞貼壁過夜,隨機(jī)分為對(duì)照組 (PBS)、青蒿素組 (0、5、10、20、40、80、160 μmol/L)、 吉 西 他 濱 組 (0、 1、 2、 4、 8、 16、32 μmol/L)、聯(lián)合用藥組1(2 μmol/L 吉西他濱聯(lián)合0、5、10、20、40 μmol/L 青蒿素)、聯(lián)合用藥組2(10 μmol/L 青蒿素聯(lián)合0、1、2、4、8 μmol/L 吉西他濱)。處理72 h 后,各組細(xì)胞加入WST-1 試劑,37 ℃下孵育2 h,檢測在450 nm波長下的光密度值 (OD 值),計(jì)算細(xì)胞存活率［ (實(shí)驗(yàn)組OD 值/對(duì)照組OD 值) ×100%］。

2.4 藥物協(xié)同作用分析 建立青蒿素、吉西他濱量效曲線,所得IC50分別設(shè)為A 和B,標(biāo)于坐標(biāo)軸上(A 標(biāo)于X軸,B 標(biāo)于Y 軸),連接A、B 兩點(diǎn)的直線為相加線,代表兩者作用是相加的,同法得到聯(lián)合用藥時(shí)的IC50,兩者濃度分別設(shè)為2、10 μmol/L,其半數(shù)抑制的等效點(diǎn)(a,b)如果在A、B 連線上,表示聯(lián)合用藥為相加作用；在該連線以下,表示聯(lián)合用藥為協(xié)同作用；在該連線以上,表示聯(lián)合用藥為拮抗作用。

2.5 Annexin V-FITC 雙染法 將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組(PBS)、青蒿素組(10 μmol/L)、吉西他濱組(2 μmol/L)、聯(lián)合用藥組(青蒿素10 μmol/L、吉西他濱2 μmol/L)。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn),加入藥物處理48 h 后,收集細(xì)胞至少1×105個(gè),PBS 沖洗后,依次加入FITC-Annexin V和PI 染色液,避光條件下孵育,通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光檢測。

2.6 線粒體膜電位檢測 分組同“2.5” 項(xiàng)。藥物處理48 h后取5×105個(gè)細(xì)胞,重懸于0.5 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液中,加入0.5 mL JC-1 染色工作液,37 ℃下孵育20 min,4 ℃下600×g 離心3 min,收集細(xì)胞,1 mL JC-1 染色緩沖液(1X)沖洗細(xì)胞2 次,適量JC-1 染色緩沖液(1X) 重懸,通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光檢測。檢測JC-1 單體時(shí),激發(fā)光波長設(shè)置為490 nm,發(fā)射光波長設(shè)置為530 nm；檢測JC-1 聚合物時(shí),激發(fā)光波長設(shè)置為525 nm, 發(fā)射光波長設(shè)置為590 nm。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 19.0 軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)以表示,3 組及3 組以上數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用方差分析(One-way ANOVA),兩兩比較選擇LSD 法,所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少3 次。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 青蒿素聯(lián)合吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用協(xié)同抑制LOVO、HT29細(xì)胞生長 表1、圖1A 顯示,吉西他濱可抑制LOVO、HT29 細(xì)胞生長,具有濃度依賴性,在0 ～2 μmol/L 范圍內(nèi)2 種細(xì)胞生長并未受到顯著抑制,而在4～8 μmol/L 范圍內(nèi)明顯受到抑制,IC50分別為7.68、8.18 μmol/L。

表1、圖1 B 顯示,青蒿素對(duì)2 種細(xì)胞的抑制作用也具有濃度依賴性,在0 ～20 μmol/L 范圍內(nèi)無顯著抑制作用,而在40～160 μmol/L 范圍具有顯著抑制作用,IC50分別為57.34、54.22 μmol/L。

表1、圖1C、1D 顯示,聯(lián)合用藥組1、聯(lián)合用藥組2均能顯著抑制2 種細(xì)胞增殖。與10 μmol/L 青蒿素聯(lián)合時(shí),對(duì)吉西他濱的IC50分別為3.12、3.49 μmol/L；與2 μmol/L吉西他濱聯(lián)合時(shí), 對(duì)青蒿素的 IC50分別為 24.57、22.36 μmol/L。通過Isobologram 分析發(fā)現(xiàn),所得IC50落在相加線左下方,表明2 種藥物具有協(xié)同作用,見圖1 E、1F。

圖1 青蒿素、吉西他濱對(duì)LOVO、HT29 細(xì)胞生長的抑制作用

表1 各組OD 值測定結(jié)果n=3）

表1 各組OD 值測定結(jié)果n=3）

注：與對(duì)照組比較,*P＜0.05

組別 濃度/(μmol·L-1) LOVO HT29對(duì)照組 — 0.963±0.056 0.958±0.039聯(lián)合用藥組1 0 μmol/L 吉西他濱+10 μmol/L 青蒿素 0.952±0.017 0.925±0.025 1 μmol/L 吉西他濱+10 μmol/L 青蒿素 0.822±0.014* 0.824±0.019*2 μmol/L 吉西他濱+10 μmol/L 青蒿素 0.641±0.038* 0.698±0.041*4 μmol/L 吉西他濱+10 μmol/L 青蒿素 0.521±0.005* 0.564±0.024*8 μmol/L 吉西他濱+10 μmol/L 青蒿素 0.331±0.025* 0.341±0.026*聯(lián)合用藥組2 2 μmol/L 吉西他濱+0 μmol/L 青蒿素 0.956±0.025 0.903±0.02 2 μmol/L 吉西他濱+5 μmol/L 青蒿素 0.856±0.029* 0.818±0.018*2 μmol/L 吉西他濱+10 μmol/L 青蒿素 0.641±0.037* 0.698±0.041*2 μmol/L 吉西他濱+20 μmol/L 青蒿素 0.509±0.026* 0.576±0.013*2 μmol/L 吉西他濱+40 μmol/L 青蒿素 0.334±0.018* 0.349±0.032*青蒿素組 0 0.975±0.009 0.980±0.009 5 0.961±0.031 0.943±0.029 10 0.952±0.017 0.925±0.026 20 0.922±0.014 0.862±0.029*40 0.717±0.042* 0.667±0.021*80 0.429±0.022* 0.421±0.011*160 0.216±0.076* 0.241±0.026*吉西他濱組 0 0.979±0.022 0.987±0.008 1 0.948±0.016 0.951±0.006 2 0.931±0.023 0.903±0.02 4 0.828±0.013* 0.881±0.031*8 0.656±0.025* 0.623±0.013*16 0.431±0.032* 0.406±0.041*32 0.256±0.025* 0.221±0.007*

3.2 青蒿素、吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)LOVO、HT29 細(xì)胞凋亡 表2、圖2 顯示,與對(duì)照組比較,10 μmol/L 青蒿素組、2 μmol/L 吉西他濱組LOVO、HT29 細(xì)胞凋亡比例并未顯著增加(P＞0.05),但聯(lián)合用藥組2 種細(xì)胞凋亡比例顯著升高(P＜0.05)。

表2 各組細(xì)胞凋亡率（%，n=3）

表2 各組細(xì)胞凋亡率（%，n=3）

注：與對(duì)照組比較,*P＜0.05

組別 LOVO HT29對(duì)照組 5.462±0.368 6.833±0.409青蒿素組 5.558±1.053 6.725±0.562吉西他濱組 5.525±1.106 7.692±0.566聯(lián)合用藥組 16.910±0.984* 16.243±0.846*

3.3 青蒿素、吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)線粒體膜電位下降 圖3 顯示,在對(duì)照組、青蒿素組、吉西他濱組中,LOVO、HT29 細(xì)胞內(nèi)線粒體維持較高的膜電位,紅色熒光較強(qiáng),綠色熒光非常弱；聯(lián)合用藥組紅色熒光強(qiáng)度顯著減弱,綠色熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(P＜0.05),表明線粒體膜電位下降。

表3 各組JC-1 二聚體/單體熒光比值n=3）

表3 各組JC-1 二聚體/單體熒光比值n=3）

注：與對(duì)照組比較,*P＜0.05

組別 LOVO HT29對(duì)照組 12.795±0.648 9.166±1.181青蒿素組 12.725±1.392 9.391±1.066吉西他濱組 12.191±0.739 9.525±0.745聯(lián)合用藥組 2.576±0.393* 1.576±0.398*

3.4 青蒿素、吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用調(diào)控ERK1/2 信號(hào)通路和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 表4、圖4 顯示,p-ERK1/2 在LOVO、HT29 細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于在結(jié)腸正常上皮細(xì)胞(FTC)中,青蒿素組、聯(lián)合用藥組p-ERK1/2 蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.05),而吉西他濱組與對(duì)照組無顯著差異 (P ＞0.05)。青蒿素、吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用后,bax、胞漿細(xì)胞色素C 表達(dá)升高,而bcl-2、線粒體細(xì)胞色素C 表達(dá)降低,表明青蒿素、吉西他濱可以促進(jìn)細(xì)胞色素C 從線粒體釋放至胞漿。另外,青蒿素、吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用后細(xì)胞內(nèi)caspase-3 顯著增多(P＜0.05),表明它被激活。

4 討論

提高結(jié)腸癌藥物療效是有待攻克的臨床難題,探索新型治療策略對(duì)提高療效和改善預(yù)后意義重大。1979 年,青蒿素作為抗瘧藥物最初由屠呦呦教授發(fā)現(xiàn),此后它的其他藥理作用逐漸被人挖掘,在過去的15 年間,青蒿素及其衍生物的抗腫瘤功效受到學(xué)者們的重視［12］,該成分可通過抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡、抑制遷移侵襲和腫瘤血管生成等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用［13-14］。課題組前期發(fā)現(xiàn)青蒿素可誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖［11］,本實(shí)驗(yàn)對(duì)青蒿素與目前臨床常用化療藥物吉西他濱在結(jié)腸癌中的聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行了初步探討。

首先,通過WST-1 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)青蒿素、 吉西他濱對(duì)LOVO、HT29 細(xì)胞生長具有顯著抑制作用,具有濃度依賴性。雖然兩者單用在低濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖無顯著抑制作用,但聯(lián)合應(yīng)用后即可顯著抑制其增殖,并通過Isobologram 分析發(fā)現(xiàn)具有協(xié)同作用。

圖2 青蒿素、吉西他濱對(duì)LOVO、HT29 細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用

表4 各組灰度值n=3）

表4 各組灰度值n=3）

注：與對(duì)照組比較,*P＜0.05

細(xì)胞 組別 p-ERK1/2 bcl-2 線粒體細(xì)胞色素C 胞漿蛋細(xì)白胞色素C bax Caspase-3 GAPDH LOVO 對(duì)照組 1 1 1 1 1 1 1青蒿素組 0.323±0.011 1.01±0.041 0.983±0.073 0.979±0.09 1.005±0.041 1.011±0.038 1.011±0.012吉西他濱組 1.139±0.006 1.005±0.086 1.021±0.092 0.982±0.083 0.998±0.046 1.017±0.029 1.014±0.043聯(lián)合用藥組 0.354±0.024 0.361±0.044* 0.425±0.007* 2.62±0.121* 3.851±0.152*2.530±0.015*1.029±0.091 HT29 對(duì)照組 1 1 1 1 1 1 1青蒿素 0.397±0.035 1.036±0.115 0.982±0.051 0.996±0.025 1.052±0.072 1.058±0.057 1.035±0.029吉西他濱組 1.021±0.080 0.978±0.023 1.016±0.102 1.029±0.085 1.041±0.073 1.024±0.009 1.034±0.038聯(lián)合用藥組 0.397±0.017 0.335±0.0561* 0.335±0.046* 2.870±0.262* 3.121±0.123*2.953±0.078*1.018±0.039

接著,檢測青蒿素、吉西他濱對(duì)LOVO、HT29 細(xì)胞凋亡的作用。FITC-Annexin V/PI 實(shí)驗(yàn)顯示,兩者在低濃度時(shí)不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,但聯(lián)合用藥后即可顯著誘導(dǎo)其凋亡。細(xì)胞凋亡分為線粒體途徑凋亡、死亡受體途徑凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑凋亡,線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。JC-1 是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位的理想熒光探針［15］,在線粒體膜電位較高時(shí),它聚集在線粒體的基質(zhì)中形成聚合物,產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時(shí),它不能聚集在線粒體的基質(zhì)中,此時(shí)JC-1 為單體,產(chǎn)生綠色熒光［16］,通過JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變檢測到細(xì)胞膜電位的下降,表明青蒿素、吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用可誘導(dǎo)線粒體膜電位崩潰。然后,進(jìn)一步檢測線粒體凋亡途徑成員bax、bcl-2、細(xì)胞色素C 表達(dá),表明青蒿素聯(lián)合吉西他濱主要通過誘導(dǎo)線粒體膜電位崩潰,釋放細(xì)胞色素C 到胞漿內(nèi),進(jìn)而激活caspase-3,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

圖3 青蒿素、吉西他濱對(duì)線粒體膜電位下降的誘導(dǎo)作用

圖4 青蒿素、吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用對(duì)ERK1/2 信號(hào)通路的影響

ERK1/2 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路家族中的一員,與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程有著密切關(guān)系,是調(diào)控線粒體凋亡的重要因素［17］。在許多腫瘤中它通常處于過度激活狀態(tài),同時(shí)p-ERK1/2 表達(dá)異常增高,可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)吉西他濱耐藥［18］,而許多藥物或試劑可以通過抑制ERK1/2 信號(hào)通路進(jìn)而誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［19-20］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 與結(jié)腸正常上皮細(xì)胞相比, p-ERK1/2 在LOVO、HT29 細(xì)胞中表達(dá)顯著增高,并且青蒿素及聯(lián)合用藥可顯著抑制p-ERK1/2 表達(dá), 表明抑制ERK1/2 信號(hào)通路可能是青蒿素、吉西他濱發(fā)揮協(xié)同抗癌作用的重要機(jī)制。

綜上所述,青蒿素、吉西他濱可通過抑制ERK1/2 信號(hào)通路激活來誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖,兩者聯(lián)合應(yīng)用可望成為新型有效結(jié)腸癌的治療方案。