李光環(huán)　索肖園　史靈燕　鄭素月　郭金英

摘要：以鮑魚菇為材料，擬研究穩(wěn)滲劑種類、酶解時間、菌絲量、菌齡對原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率的影響。結(jié)果表明，原生質(zhì)體制備的優(yōu)化條件是取菌齡為10 d、液體靜置培養(yǎng)的菌絲0.04 g，在以0.6 mol/L蔗糖作為穩(wěn)滲劑的酶液（濃度為2%）中于30 ℃酶解2 h，獲得原生質(zhì)體的產(chǎn)量為1.2×107個/mL。在優(yōu)化條件下得到的原生質(zhì)體再生率達(dá)到 0.30%;對再生菌落進(jìn)行鏡檢發(fā)現(xiàn)，無鎖狀聯(lián)合的原生質(zhì)體單核菌株菌絲潔白，長勢旺盛，超過了雙核菌絲的長速。研究結(jié)果可以為鮑魚菇原生質(zhì)體融合選育新品種提供一定的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：鮑魚菇;原生質(zhì)體;制備;再生;單核體

中圖分類號： S646.1+41.04+3? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）04-0111-02

鮑魚菇（Pleurotus abalonus）子實(shí)體肥大，風(fēng)味似鮑魚，清香脆嫩，是食藥兼用的珍稀食用菌之一。利用多種原料在夏季栽培鮑魚菇，可以彌補(bǔ)冀中南地區(qū)夏季鮮菇產(chǎn)品缺乏的狀況。此外，通過選育鮑魚菇的新品種可以逐步解決冀中南地區(qū)夏季鮮菇的供應(yīng)問題[1]。

原生質(zhì)體技術(shù)是近年來迅速發(fā)展起來的細(xì)胞生物工程育種新技術(shù)，原生質(zhì)體的制備與再生是原生質(zhì)體育種技術(shù)的基礎(chǔ)[2]。迄今，國內(nèi)外許多學(xué)者已經(jīng)從60多種食用菌中成功制備出原生質(zhì)體，并對原生質(zhì)體的育種技術(shù)進(jìn)行了大量探索。研究發(fā)現(xiàn)，在金針菇[3]、香菇[4]、白靈菇[5]中都有少量單核原生質(zhì)體被分離出來。潘迎捷等研究發(fā)現(xiàn)，單核化現(xiàn)象在平菇、香菇、鳳尾菇、金針菇等異宗結(jié)合的食用菌中非常普遍[6]。單核體是異宗結(jié)合食用菌雜交育種的基本材料，在食用菌育種中具有明顯的開拓性。目前關(guān)于鮑魚菇原生質(zhì)體制備及再生的研究鮮有報(bào)道，本研究擬探索鮑魚菇原生質(zhì)體制備及再生條件，并在優(yōu)化條件下制備獲得原生質(zhì)體優(yōu)良單核菌株，旨在為鮑魚菇原生質(zhì)體融合選育新品種提供重要的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 鮑魚菇，為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存的菌株。

1.1.2 供試培養(yǎng)基及試劑 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，簡稱PDA）綜合培養(yǎng)基;0.6 mol/L蔗糖再生培養(yǎng)基;0.6 mol/L甘露醇再生培養(yǎng)基;溶壁酶，購自廣東省微生物研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌絲培養(yǎng) 用PDA綜合培養(yǎng)基活化菌絲，研磨后置于50 mL液體PDA培養(yǎng)基中，于25 ℃黑暗靜置培養(yǎng)。

1.2.2 原生質(zhì)體的制備 在無菌操作條件下將培養(yǎng)的菌絲過濾收集，先后用無菌水、穩(wěn)滲劑分別漂洗離心（5 000 r/min，6 min）2次。將洗滌好的菌絲用濾紙吸干水分并稱質(zhì)量，采用單因素試驗(yàn)分別研究穩(wěn)滲劑種類、酶解時間、菌絲量、菌齡等因素對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響。將菌絲放入預(yù)熱的酶解液中，置于30 ℃水浴鍋中酶解，每隔10 min搖動1次，使酶解液和菌絲充分接觸，從而加快酶解速度。在酶解過程中定時取酶液置于血球計(jì)數(shù)板上鏡檢觀察原生質(zhì)體的釋放情況。酶解終止后用無菌脫脂棉過濾除去殘留菌絲，將濾液于 4 000 r/min 離心10 min，棄清液，收集沉淀，用穩(wěn)滲劑適當(dāng)稀釋后得到純化的原生質(zhì)體懸液。

1.2.3 原生質(zhì)體的再生 原生質(zhì)體用穩(wěn)滲劑稀釋至適宜濃度，設(shè)置3個濃度梯度，每個梯度取0.1 mL原生質(zhì)體懸液涂布于再生培養(yǎng)基平板上，于25 ℃遮光培養(yǎng)。獲取再生菌落，觀察計(jì)數(shù)，計(jì)算再生率。以不加穩(wěn)滲劑的PDA平板作對照，再生率的計(jì)算公式如下：

再生率=（再生培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)-PDA培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)）/接種數(shù)×100%。

1.2.4 原生質(zhì)體再生菌落的鑒定 將涂布于再生培養(yǎng)基上的原生質(zhì)體進(jìn)行遮光培養(yǎng)，肉眼可觀察到星芒狀或點(diǎn)狀的再生菌落，挑選再生菌落于試管斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，鏡檢，根據(jù)有無鎖狀聯(lián)合確定是單核還是雙核菌絲。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體制備條件

2.1.1 穩(wěn)滲劑種類對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 分別以 0.6 mol/L 甘露醇、蔗糖為穩(wěn)滲劑（酶濃度為2%），于30 ℃酶解3 h，每隔0.5 h取樣測定原生質(zhì)體產(chǎn)量。由圖1可以看出，酶解開始時，原生質(zhì)體隨著酶解的進(jìn)行逐漸釋放，原生質(zhì)產(chǎn)量逐漸上升直至達(dá)到峰值，以甘露醇作為穩(wěn)滲劑酶解1.5 h時，原生質(zhì)體產(chǎn)量高于以蔗糖作為穩(wěn)滲劑的，隨后低于以蔗糖作為穩(wěn)滲劑的，以甘露醇作為穩(wěn)滲劑處理的原生質(zhì)體產(chǎn)量在1.5 h時達(dá)到峰值1.1×107個/mL，以蔗糖作為穩(wěn)滲劑處理的原生質(zhì)體產(chǎn)量在2.0 h時達(dá)到峰值1.0×107個/mL。2.0 h 后，酶活性逐漸降低，且原生質(zhì)體隨著酶解時間的延長會破裂，原生質(zhì)體產(chǎn)量呈下降趨勢。

2.1.2 菌絲量對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 分別稱取0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g菌絲放入以0.6 mol/L蔗糖作為穩(wěn)滲劑的無菌酶解液中（酶濃度為2%），于30 ℃酶解2 h后，檢測原生質(zhì)體產(chǎn)量。由圖2可以看出，0.04 g菌絲量的原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，達(dá)到9.5×106個/mL，之后隨著菌絲量的增加，原生質(zhì)體產(chǎn)量出現(xiàn)了下降趨勢。

2.1.3 酶解時間對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 取菌絲置于以06 mol/L蔗糖作為穩(wěn)滲劑的無菌酶解液中，于30 ℃酶解1、2、3、4 h，在不同時間取樣測定原生質(zhì)體產(chǎn)量。圖3結(jié)果表明，在1～2 h之間，原生質(zhì)體產(chǎn)量隨著酶解時間的延長而迅速增加，在2 h時酶解所得原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，為1.1×107個/mL，隨后原生質(zhì)體產(chǎn)生量逐步下降，由此可見，制備鮑魚菇的原生質(zhì)體酶解時間以2 h為宜。

2.1.4 菌齡對鮑魚菇原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 分別取培養(yǎng)6、8、10、12、14 d的菌絲體，在以0.6 mol/L蔗糖為穩(wěn)滲劑的無菌酶解液中于30 ℃酶解2 h，檢測原生質(zhì)體的產(chǎn)量。由于鮑魚菇菌絲較其他側(cè)耳屬品種生長速度慢，培養(yǎng)的前5 d菌絲量較少，因此不適合用于制備原生質(zhì)體。圖4結(jié)果表明，從培養(yǎng)6 d開始，隨著菌齡的增加，原生質(zhì)體產(chǎn)量開始遞增，培養(yǎng)10 d時的原生質(zhì)體產(chǎn)量為1.20×107個/mL，到培養(yǎng)12 d時，原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，達(dá)到1.38×107個/mL，但是培養(yǎng)12 d以后，原生質(zhì)體產(chǎn)生量開始明顯下降。

2.2 原生質(zhì)體再生結(jié)果

2.2.1 不同穩(wěn)滲劑再生培養(yǎng)基對原生質(zhì)體再生率的影響 分別以0.6 mol/L甘露醇、蔗糖作為穩(wěn)滲劑，在培養(yǎng)12 d時，蔗糖培養(yǎng)基上原生質(zhì)體再生率為0.30%，而甘露醇培養(yǎng)基只有0.05%。綜合考慮，以0.6 mol/L蔗糖再生培養(yǎng)基作為優(yōu)選培養(yǎng)基。

2.2.2 不同菌齡對原生質(zhì)體再生率的影響 分別選取菌齡為6、8、10、12、14 d的菌絲體，檢測原生質(zhì)體的再生率。由表1可以看出，菌齡為8、10 d的原生質(zhì)體再生率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他菌齡的，以菌齡為10 d的菌絲原生質(zhì)體再生率最高，達(dá)0.30%。

2.3 原生質(zhì)體再生菌落的鑒定分析

通過對再生菌落進(jìn)行鏡檢發(fā)現(xiàn)，鮑魚菇有鎖狀聯(lián)合的雙核菌株都長有分生孢子梗束，頂部呈黑色球形，梗呈白色，而無鎖狀聯(lián)合的單核菌株菌絲潔白，呈絨毛狀，長勢旺盛。從菌絲長勢及顯微結(jié)構(gòu)觀察初步看出，挑取的單核菌絲更加粗壯，經(jīng)測定，單核菌絲在培養(yǎng)10 d時長滿直徑為90 mm的培養(yǎng)皿，雙核菌絲在培養(yǎng)16 d時長滿直徑為90 mm的培養(yǎng)皿，單核菌絲體在長勢和長速上均超過了雙核菌絲（圖5）。

3 結(jié)論與討論

本研究得出鮑魚菇原生質(zhì)體制備的優(yōu)化條件：用液體靜置培養(yǎng)的菌齡為10 d的0.04 g菌絲，在以0.6 mol/L蔗糖作為穩(wěn)滲劑的酶液（濃度為2%）中于30 ℃酶解2 h， 原生質(zhì)體

產(chǎn)量為1.2×107個/mL。在優(yōu)化的條件下，得到的原生質(zhì)體再生率達(dá)到0.30%。影響原生質(zhì)體釋放的因素很多，本試驗(yàn)通過對鮑魚菇原生質(zhì)體制備條件和再生的研究，明確了在液體靜置培養(yǎng)的條件下，穩(wěn)滲劑種類、酶解時間、菌絲量、菌齡對原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生的影響。本研究通過對鮑魚菇菌絲進(jìn)行液體培養(yǎng)制備原生質(zhì)體，首先對穩(wěn)滲劑種類進(jìn)行選擇，在本試驗(yàn)中，以甘露醇作穩(wěn)滲劑制備獲得的原生質(zhì)體產(chǎn)量在酶解 0～1.5 h內(nèi)高于以蔗糖作為穩(wěn)滲劑的，與周霞等報(bào)道的以甘露醇作為穩(wěn)滲劑制備獲得的原生質(zhì)體產(chǎn)量高于蔗糖的研究結(jié)果[7]一致，但因以蔗糖作為穩(wěn)滲劑時，再生率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于甘露醇，因而本試驗(yàn)均采用蔗糖作穩(wěn)滲劑。

在前人的相關(guān)研究中，原生質(zhì)體單核菌絲長速一般低于雙核菌絲，本試驗(yàn)選出的幾個鮑魚菇單核菌絲長速明顯快于雙核菌絲，其機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

本研究通過對鮑魚菇原生質(zhì)體制備及再生條件的初步研究，優(yōu)化了其制備條件，獲得了原生質(zhì)體優(yōu)良單核菌株，為鮑魚菇原生質(zhì)體融合選育新品種提供了重要的研究基礎(chǔ)。

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