高璐　薛永來

摘要：農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系被廣泛應(yīng)用于水稻功能基因研究、T-DNA插入突變體庫創(chuàng)建和農(nóng)藝性狀改良等研究領(lǐng)域。然而水稻轉(zhuǎn)基因操作需要超過3個月的組織培養(yǎng)時間。運用組織培養(yǎng)和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，對水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系進行快速高效的優(yōu)化。結(jié)果表明，成熟種子用2，4-D誘導(dǎo)愈傷7 d后，與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化效率最佳;抗性篩選時間以2～4周為最佳。根據(jù)以上優(yōu)化條件，從成熟種子誘導(dǎo)愈傷至獲得轉(zhuǎn)基因株系的時間被縮短到6周左右。將有效降低水稻長時間組培導(dǎo)致的體細胞無性系變異概率，對促進水稻分子育種的發(fā)展有重要意義。

關(guān)鍵詞：粳稻;農(nóng)桿菌介導(dǎo);遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號： S511.2+20.1? 文獻標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）04-0039-03

水稻高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立是進行水稻功能基因分析、創(chuàng)建T-DNA插入突變體庫和分子遺傳改良的技術(shù)基礎(chǔ)。然而一般來講，在獲得水稻轉(zhuǎn)基因株系前，至少需要3個月以上的組織培養(yǎng)時間，這使得水稻的分子生物學(xué)相關(guān)研究周期遠比其他物種漫長。另有文獻報道，長時間的體外組織培養(yǎng)可能引起水稻愈傷組織的無性系變異，導(dǎo)致基因組改變[1]。因此建立高效快速的轉(zhuǎn)化體系，不僅能夠提高操作效率，還可以盡可能地減少細胞無性系變異，對水稻基因工程研究有重要意義[2-6]。

研究認為，水稻成熟種子誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)至少2～3周后，獲得的愈傷組織才適用于農(nóng)桿菌侵染[1，7-8]。但是Toki等曾報道農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高速的水稻轉(zhuǎn)基因體系，認為在水稻愈傷培養(yǎng)1 d后即可進行侵染共培養(yǎng)試驗[9]。但也有研究認為早期侵染并不能獲得足夠的陽性抗性愈傷，轉(zhuǎn)化率低于10%[10]。本研究就水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系中預(yù)培養(yǎng)以及抗性篩選階段的條件進行摸索，在保證高效農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化率的同時，建立既高效又高速的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系。

1 材料與方法

試驗于2015年12月至2016年10月在江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院生物質(zhì)能源研究所能源植物研究室進行。使用的水稻（Oryza sativa）品種為日本晴和南粳9108。

1.1 質(zhì)粒構(gòu)建

本研究使用的表達載體pBINPLUS為筆者所在實驗室保存，在AscⅠ和PacⅠ酶切位點之間插入RbcS1啟動子和終止子序列，構(gòu)建成pBINR載體，將該載體使用凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌植株EHA105中[11]。

1.2 培養(yǎng)基

本試驗所使用各種培養(yǎng)基均列于表1中。

1.3 植物材料與預(yù)培養(yǎng)

試驗使用粳稻品種日本晴和南粳9108由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，其中南粳9108為江蘇省內(nèi)及周邊地區(qū)廣泛種植的推廣品種。水稻種子剝?nèi)シf殼加1滴含吐溫-20的5%次氯酸鈉溶液浸泡消毒15 min，然后用無菌水清洗5遍。然后再用無吐溫的次氯酸鈉溶液消毒15 min，并用無菌水沖洗10遍左右，徹底去除次氯酸鈉殘留。用無菌濾紙吸干種子表面水分后，種子胚向上斜插到NBD培養(yǎng)基上，16 h光照/8 h黑暗，28 ℃培養(yǎng)。每皿放置20粒種子，每個處理設(shè)6個重復(fù)。

1.4 農(nóng)桿菌侵染及轉(zhuǎn)基因植物篩選

挑取含有pBINR載體的農(nóng)桿菌單菌落于含有50 mg/L卡那霉素的AAM液體培養(yǎng)基中，28 ℃遮光200 r/min振蕩培養(yǎng)至D600 nm為0.4～0.6，離心收集菌體并用液體NB-As重懸至D600nm=0.1。選取大小合適、狀態(tài)良好的的愈傷組織，浸入農(nóng)桿菌重懸液中30 min，在無菌濾紙上吸干多余菌液后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到鋪有1層無菌濾紙的固體NBD-As培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3 d。將愈傷用無菌水清洗3遍，之后用含有 150 mg/L Timentin的無菌水浸泡10 min，將愈傷多余水分吸干，轉(zhuǎn)移至NBD-As培養(yǎng)基恢復(fù)培養(yǎng)4 d。之后轉(zhuǎn)移到含有篩選抗生素卡那霉素的NBD-TK培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選培養(yǎng)，每2周繼代1次。有卡那霉素抗性的愈傷組織轉(zhuǎn)移入分化培養(yǎng)基RE1中，催化的不定芽生長至3～5 cm小苗時，將小苗切割并轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基RE2中進行生根誘導(dǎo)，獲得T0代幼苗。

1.5 轉(zhuǎn)基因植物的分子鑒定

取T0代幼苗葉片0.1 g，采用TaKaRa植物基因組DNA小量純化試劑盒（No. 9768）提取水稻總DNA。根據(jù)RbcS1啟動子和終止子序列避開水稻同源序列，設(shè)計合成引物，序列為P1：5′-TTTAGGAGATACCAGCCAGG-3′;P2：5′-AACTTAGTAGCCATCGGGC-3′，PCR退火溫度為55 ℃，循環(huán)次數(shù)為30次。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，在 800 bp 左右有目的條帶即為陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)培養(yǎng)條件對水稻愈傷培養(yǎng)的影響

水稻胚誘導(dǎo)愈傷組織受到多方面因素的影響。本試驗發(fā)現(xiàn)種子的狀態(tài)和光照對水稻愈傷的生長有明顯影響。優(yōu)良的種子狀態(tài)是愈傷生成的關(guān)鍵因素（表2）。在剝除穎殼的過程中根據(jù)形態(tài)等因素對種子進行初步篩選，對后期水稻愈傷組織的成功誘導(dǎo)有很重要的作用。另外，對比暗培養(yǎng)和光照培養(yǎng)的水稻愈傷發(fā)現(xiàn)，光照培養(yǎng)下的愈傷組織生長更快，呈淺黃色且較致密，更有利于縮短培養(yǎng)時間和分化誘導(dǎo)。

2.2 預(yù)培養(yǎng)時間對農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化效率的影響

預(yù)培養(yǎng)時間對日本晴和南粳9108這2個品種的轉(zhuǎn)化率有明顯的影響。經(jīng)過2～3次繼代的愈傷轉(zhuǎn)化效率最高，明顯高于培養(yǎng)4周未繼代直接侵染的愈傷組織。繼代超過4次的2個品種的轉(zhuǎn)化率均開始明顯下降，同時分化能力也明顯下降。說明長時間的誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)對水稻基因轉(zhuǎn)化率和分化率都有影響。研究發(fā)現(xiàn)2個品種預(yù)培養(yǎng)4 d和7 d后直接進行農(nóng)桿菌侵染，也能獲得較高的轉(zhuǎn)化率，其中預(yù)培養(yǎng)7 d后的基因轉(zhuǎn)化率高達69.0%和61.7%，接近繼代2～3次后水稻愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率（表3）。

2.3 篩選時間對分化效率的影響

水稻愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后，被轉(zhuǎn)入含有篩選抗生素的篩選培養(yǎng)基上，以篩選出成功將目的基因整合入植物基因組的陽性克隆。為提高農(nóng)桿菌侵染效率，將農(nóng)桿菌菌體收集并用 NB-As 培養(yǎng)基重新懸浮菌體至 D600 nm為0.1。 試驗證明，較低的農(nóng)桿菌密度不但能夠提高轉(zhuǎn)化效率（數(shù)據(jù)未顯示），并且容易洗清，避免因農(nóng)桿菌生長旺盛無法徹底去除而將愈傷組織包埋、影響愈傷組織生長的現(xiàn)象。

篩選培養(yǎng)的時間對愈傷組織分化效率也有影響。篩選時間太短，假陽性克隆太多，加大了后期分子生物學(xué)鑒定的工作量;篩選時間太長，不但拖延科研時間，還會出現(xiàn)因愈傷組織培養(yǎng)時間太長而導(dǎo)致分化能力下降的現(xiàn)象。如表4所示，篩選培養(yǎng)繼代2次以內(nèi)，水稻愈傷組織的分化效率在80%左右，隨著繼代次數(shù)的增加，分化效率有降低的趨勢，且延長是整個體系的操作時間。

2.4 轉(zhuǎn)基因水稻幼苗的PCR驗證

將生根后的不定芽幼苗從培養(yǎng)基中取出，移栽到含有營養(yǎng)土的水桶中，在溫室中栽培，即可繼續(xù)生長直至收獲。為進一步鑒定陽性植株中目的基因的存在，對T0代幼苗的葉片進行PCR鑒定。結(jié)果如圖1所示，2個水稻品種的轉(zhuǎn)化率沒有差異，說明本體系對該2個品種均適用。同時篩選培養(yǎng)時間對水稻的植株轉(zhuǎn)化率也沒有明顯影響（數(shù)據(jù)未顯示）。

3 討論與結(jié)論

水稻是我國重要的糧食作物，也是農(nóng)業(yè)科學(xué)和植物學(xué)研究的重要模式植物。建立高效的水稻轉(zhuǎn)化體系，是水稻功能基因研究、性狀改良、抗性提高等科學(xué)研究的技術(shù)基礎(chǔ)。自1994年Hiei等報道水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)以來，國內(nèi)外的科研工作者通過培養(yǎng)基改良、操作步驟優(yōu)化等措施，不斷改進優(yōu)化水稻的基因轉(zhuǎn)化體系，實現(xiàn)了水稻轉(zhuǎn)化率的大幅提高[7，9-10，12-16]。近年來，無選擇標(biāo)記技術(shù)更是廣泛應(yīng)用于水稻新品系的培育[17-19]。試驗材料是水稻農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的重要基礎(chǔ)。本研究采用成熟種子為試驗材料，材料簡單易得，經(jīng)過初步的篩選，愈傷誘導(dǎo)率可以高達90%以上，預(yù)培養(yǎng)7 d作為轉(zhuǎn)化的受體材料，轉(zhuǎn)化率可達60%～70%，完全滿足研究需要。本系統(tǒng)使用較高濃度的次氯酸鈉和吐溫-20對水稻種子進行2次消毒。該方法簡單易行，在實際操作中污染率基本為零，而且同時還去除了種子表面各種油和蠟質(zhì)，有利于農(nóng)桿菌的順利侵染[9]。光照在水稻種子萌發(fā)和愈傷生成中也有重要的作用，與暗培養(yǎng)相比較，長日照條件下培養(yǎng)的愈傷組織生長更快、結(jié)構(gòu)更加緊密，這種愈傷有利于后期芽的分化[10，14，20-22]。

本研究主要針對水稻轉(zhuǎn)基因體系中耗時較長的2個步驟（即愈傷組織預(yù)培養(yǎng)和抗性篩選過程）進行優(yōu)化。過去的大量研究中，水稻在含有2，4-D的培養(yǎng)基上培養(yǎng)28 d以上，誘導(dǎo)出足夠的愈傷組織用來轉(zhuǎn)基因操作。Toki等曾報道，愈傷誘導(dǎo)1～5 d后用農(nóng)桿菌侵染即可獲得較高的轉(zhuǎn)化率[9]。但是筆者多次試驗并沒有達到文獻報道的高轉(zhuǎn)化率。結(jié)合前期經(jīng)驗，對水稻轉(zhuǎn)基因部分步驟進行摸索優(yōu)化，最終發(fā)現(xiàn)，在含有2，4-D的培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，能獲得可接受的高轉(zhuǎn)化率，且結(jié)果穩(wěn)定。同時較低濃度的農(nóng)桿菌不僅能夠獲得更高的轉(zhuǎn)化率，還避免了后期因農(nóng)桿菌濃度過高引起的愈傷感染過度或農(nóng)桿菌污染引起的愈傷褐化死亡[13，15，22]。在抗性篩選階段，研究發(fā)現(xiàn)2周以上的抗性篩選過程即可有效地去除未整合目的基因的陰性愈傷，同時獲得高效分化的陽性愈傷組織。以上結(jié)果與文獻報道結(jié)果[13，15，20-23]相似，且得到后期分子生物學(xué)手段驗證。通過以上2個步驟的優(yōu)化，將水稻轉(zhuǎn)基因操作體系縮短到6周以內(nèi)，提高了工作效率，對于水稻的功能基因研究乃至分子遺傳育種都有重要意義。

在農(nóng)作物生理生化和分子遺傳育種研究工作中，水稻轉(zhuǎn)基因體系已經(jīng)是必不可少的技術(shù)平臺之一。本研究通過優(yōu)化預(yù)培養(yǎng)和抗性篩選2個步驟，縮短了水稻轉(zhuǎn)基因的操作周期，為提高科研效率提供了可能。同時，根據(jù)該項研究的結(jié)果，可對其他水稻品種以及禾本科其他植物的轉(zhuǎn)化進行優(yōu)化研究。本體系的擴大應(yīng)用將有助于利用分子生物學(xué)手段對禾本科植物的功能基因組和農(nóng)藝價值改良的深入研究。

參考文獻：

[1]Labra M，Savini C，Bracale M，et al. Genomic changes in transgenic rice （Oryza sativa L.） plants produced by infecting calli with Agrobacterium tumefaciens[J]. Plant Cell Reports，2001，20（4）：325-330.

[2]呂 彥，王平榮，孫業(yè)盈，等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化在水稻基因工程育種中的應(yīng)用[J]. 分子植物育種，2005，3（4）：543-549.

[3]張 欣，付亞萍，周君莉，等. 水稻規(guī)模化轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系構(gòu)建與應(yīng)用[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47（21）：4141-4154.

[4]Yamauchi T，Iida S.Gene targeting in crop species with effective selection systems[M]. Double-strand break repair and its application to genome engineering in plants. New York：Springer，2015：91-111.

[5]顏文飛，張啟軍，秦海龍，等. 運用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的針刺法將外源基因轉(zhuǎn)入水稻[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015，31（4）：718-724.

[6]張喜娟，來永才，孟 英，等. 粳稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系的研究與應(yīng)用進展[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017（4）：136-139.

[7]Hiei Y，Ohta S，Komari T，et al. Efficient transformation of rice （Oryza sativa L.） mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA[J]. The Plant Journal，1994，6（2）：271-282.

[8]Hiei Y K T，Kubo T. Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens[J]. Plant Molecular Biology，1997，35（1/2）：205-218.

[9]Toki S，Hara N，Ono K，et al. Early infection of scutellum tissue with Agrobacterium allows high-speed transformation of rice[J]. The Plant Journal，2006，47（6）：969-976.

[10]陳 惠，趙 原，種 康. 一種改進的水稻成熟胚愈傷組織高效基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)[J]. 植物學(xué)通報，2008，25（3）：322-331.

[11]Holsters M，de Waele D，Depicker A，et al. Transfection and transformation of Agrobacterium tumefaciens[J]. Molecular & General Genetics，1978，163（2）：181-187.

[12]Komari T，Hiei Y，Ishida Y，et al. Advances in cereal gene transfer[J]. Current Opinion in Plant Biology，1998，1（2）：161-165.

[13]牟 晨，金 菁，石金磊. 根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)基因方法的

優(yōu)化研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（7）：3867，3880.

[14]王北艷，向殿軍，殷奎德. 提高粳稻成熟胚抗性愈傷再生頻率的研究[J]. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2012，24（1）：28-31.

[15]周 艷，黃亞萍，周 遙，等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化秈稻Kasalath的條件優(yōu)化[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2013，39（5）：471-477.

[16]易自力，曹守云，王 力，等. 提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻頻率的研究[J]. 遺傳學(xué)報，2001，28（4）：352-358.

[17]段忠衛(wèi)，李希臣，張 軍，等. 無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)高賴氨酸蛋白基因水稻植株的培育[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，44（7）：46-51.

[18]馮夢詩，葉 俊，侯莉莉，等. 無選擇標(biāo)記基因的優(yōu)質(zhì)香稻新品系培育[J]. 華北農(nóng)學(xué)報，2015，30（5）：92-96.

[19]Mejima M，Kashima K，Kuroda M，et al. Determination of genomic location and structure of the transgenes in marker-free rice-based cholera vaccine by using whole genome resequencing approach[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2015，120（1）：35-48.

[20]王春萍，謝樹章，蔣曉英，等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的秈稻科恢675快速遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2012，25（1）：1-5.

[21]李素娟，樊秀霞，王 華，等. 水稻不同品種組培再生和轉(zhuǎn)基因頻率研究[J]. 核農(nóng)學(xué)報，2013，27（12）：1817-1827.

[22]張燕紅，趙志強，吳澤新，等. 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，51（8）：1457-1462.

[23]周 蕾，陳 晨. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)化研究[J]. 農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2015，35（17）：33-34，37.仵 陶，安勝軍，邵鐵梅，等. 微型人胰島素基因載體的構(gòu)建及其在花生中的表達[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（4）：42-46.