陳亮等

摘 要： 大量高質(zhì)量且能再生的原生質(zhì)體是真菌遺傳轉(zhuǎn)化、基因修飾的重要保證。本試驗選用蘋果腐爛病菌強(qiáng)致病力菌株SDAU11-175，從酶種類、菌絲年齡、酶解時間、滲透壓穩(wěn)定劑及再生培養(yǎng)基五個方面對原生質(zhì)體制備及再生條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示：獲得蘋果腐爛病菌原生質(zhì)體最大產(chǎn)量的條件是菌絲年齡54 h、3%崩潰酶和3%裂解酶組合、0.7 mol/L NaCl作為滲透壓穩(wěn)定劑、28℃酶解3 h，所得原生質(zhì)體在YPS培養(yǎng)基上再生效果最好，再生率可達(dá)42.21%。

關(guān)鍵詞： 蘋果腐爛病菌；原生質(zhì)體；制備；再生

中圖分類號： S436.611.1+1 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號： 1001 - 4942（2014）08 - 0109 - 04

Optimization of Protoplast Preparation and Regeneration Conditions

of Valsa mali var. mali

Chen Liang1， Lun Yingying1， Sun Gengwu1， Zhao Yingtong1，

He Bangling1， Wang Hongkai2*， Liu Huixiang1*

（1. College of Plant Protection， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China；

2. Biotechnology Institute， Zhejiang University， Hangzhou 310058， China）

Abstract Protoplasts with high quality and high regeneration rate are essential in genetic transformation and gene modification of fungi. Using highly pathogenic Valsa mali var. mali strain SDAU11-175 as research object， the protoplast preparation and regeneration conditions were optimized from five aspects of enzyme types， mycelia age， enzymolysis time， osmotic stabilizer and regeneration medium. The results showed that the conditions to obtain the maximum protoplast output were culturing mycelia for 54 hours and treating them with 3% driselase and 3% lysing enzymes for 3 hours at 28℃ using 0.7 mol/L NaCl as osmotic stabilizer. The protoplasts regenerated best on YPS medium with the regeneration rate as 42.21%.

Key words Valsa mali var. mali； Protoplast； Preparation； Regeneration

蘋果腐爛病（Apple Valsa Canker）又稱爛皮病、臭皮病，是蘋果的重要病害之一，其病原主要為 Valsa mali var. mali。 該病菌可引起許多落葉樹木的腐爛病[1]，對于蘋果樹主要通過樹體傷口進(jìn)行侵染，引起樹木皮層腐爛潰瘍，主枝和較大的側(cè)枝頂梢枯死乃至整株樹木死亡，是制約中國、日本以及朝鮮半島蘋果產(chǎn)量的重要因素[2～4]。

目前國內(nèi)對于蘋果腐爛病菌的防控主要從化學(xué)、生物及物理防治[5～8]等方面開展了研究，但這些方法都不能很好地控制該病菌。利用遺傳操作方法對該病菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，構(gòu)建突變體庫，尋找致病基因，可以了解其致病機(jī)制，提供更好的防控手段。此外利用轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入報告基因，例如利用 gfp 基因的表達(dá)，可以有效地示蹤病原菌的侵染過程、定植過程以及與寄主的互作過程[9]，大量高質(zhì)量且能夠再生的原生質(zhì)體是實現(xiàn)上述轉(zhuǎn)化的必要和關(guān)鍵。對于真菌的原生質(zhì)體的制備技術(shù)，國內(nèi)外文獻(xiàn)均有記載[10～12]，但由于不同真菌細(xì)胞壁組成成分有所不同，因此酶解的條件差異較大。本研究首次對蘋果腐爛病菌原生質(zhì)體的制備及再生條件進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了一種高效制備蘋果腐爛病菌原生質(zhì)體的方法，為建立該病菌的遺傳轉(zhuǎn)化及其他相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株及試劑 供試菌株為蘋果腐爛病菌 （Valsa mali var. mali） SDAU11-175菌株，由本實驗室保存。試劑為崩潰酶（Driselase）和溶壁酶（Lyzing Enzymes），美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基（常規(guī)方法），PDB培養(yǎng)基（PDA配方中不添加瓊脂粉），PDS培養(yǎng)基（PDA基配方的基礎(chǔ)上添加1 mol/L蔗糖），YPD培養(yǎng)基（Yeast extract peptone dextrose medium，酵母提取物 3.5 g，蛋白胨 5 g，葡萄糖 10 g，瓊脂粉15 g，加水至1 L），YPS培養(yǎng)基（Yeast extract peptone sucrose medium，YPD配方基礎(chǔ)上添加1 mol/L蔗糖）。STC配方：1.2 mol/L山梨醇，10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，50 mmol/L CaCl2。