楊加偉，彭遼天，程小玲

（遵義醫(yī)科大學(xué)a.生物化學(xué)教研室；b.細(xì)胞生物學(xué)教研室，貴州遵義563006）

甲硫氨酸亞砜還原酶（Msr）是催化游離或多肽鏈中的甲硫氨酸亞砜（Met-O）還原為甲硫氨酸（Met）的一類酶[1，2]。目前報道的Msr可分為三類[3-4]：MsrA、MsrB和fRMsr，其中MsrB和fRMsr分別選擇性還原多肽鏈中的-Met-O和游離的-Met-O；而MsrA則選擇性的還原游離或者多肽鏈中構(gòu)型的Met-O。手性亞砜是一類含有亞硫?；?S=O）官能團(tuán)的重要有機(jī)化合物，是很多藥物如質(zhì)子泵抑制劑埃索美拉唑、血小板粘附抑制劑OPC-29030、鉀通道激活劑Aprikalim等的關(guān)鍵組成部分[5-8]。利用生物酶選擇性地合成單一構(gòu)型的手性亞砜是目前的研究熱點，但高對映選擇性、高活性和高底物耐受的生物酶依然十分匱乏[9-11]。在本論文的前期工作中，項目組從一株假單胞菌中篩選出了一個MsrA基因并命名為MsrA[11，12]。利用MsrA重組蛋白為催化劑，有效實現(xiàn)了在底物濃度高達(dá)200mM下-構(gòu)型亞砜的高特異性合成，且產(chǎn)率接近理論最佳值[13]，展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景。但是，該酶還存在底物譜較窄，酶促反應(yīng)受底物的限制較大等不足，需要對酶進(jìn)行改造和優(yōu)化[13]。

定向進(jìn)化是通過對蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行易錯PCR、DNA改組、定點飽和突變等方法進(jìn)行連續(xù)的隨機(jī)突變、重組并通過高通量篩選方法獲得期望酶突變體的一種技術(shù)。定向進(jìn)化技術(shù)作為改造酶分子的有效策略，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用在工業(yè)、環(huán)境以及醫(yī)藥等相關(guān)生物酶分子的改造領(lǐng)域[14-16]。由于定向進(jìn)化技術(shù)需要對突變體庫進(jìn)行大量的篩選，所以實現(xiàn)對酶定向進(jìn)化改造的首要步驟就是建立起該酶的高通量活性篩選體系。因此，本研究基于前期研究結(jié)果及進(jìn)一步研究的需要，擬建立一種高通量的MsrA的活性篩選體系，為其定向進(jìn)化改造奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)與蛋白表達(dá)

1.2.2 重組菌細(xì)胞裂

1.2.3 MsrA活性測定應(yīng)混合液于96孔酶標(biāo)版，加入195L顯色液（50mM磷酸緩沖液，pH8.0，2mMDTNB），靜置于37℃反應(yīng)30min后，用酶標(biāo)儀測定各個樣品孔在412nm處的光吸收。以不含MsrA重組蛋白的細(xì)菌裂解液為空白對照，用空白對照與樣品OD412的差值衡量MsrA重組蛋白的活性。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。利用獨立樣本T檢驗法計算兩個樣品間的差異顯著性，<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義并用星號（*）標(biāo)示。差異系數(shù)（coefficientofvariation)的計算方式為一組數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差與其均值的百分比。

2 結(jié)果

2.1 MsrA基因工程菌微量培養(yǎng)體系的建立

因需要進(jìn)行大規(guī)模的篩選，本研究首先需建立一種適用于96孔培養(yǎng)板的 MsrA基因工程菌培養(yǎng)和表達(dá)體系。經(jīng)過反復(fù)摸索，本研究選用單孔容積為2mL的96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)基最終體積為1mL。為減少不同培養(yǎng)孔中由于細(xì)菌生長差異而導(dǎo)致的酶量差異，本研究先使用小體積的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌使其達(dá)到飽和。向每個培養(yǎng)孔中加入少量的LB培養(yǎng)基（0.3mL），將含MsrA重組質(zhì)粒的菌株單克隆依次挑取至各個培養(yǎng)孔中。37℃培養(yǎng)12h后，再加入大量（0.7mL）含誘導(dǎo)劑（IPTG）的新鮮培養(yǎng)基，誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，經(jīng)過24h的誘導(dǎo)培養(yǎng)，每個培養(yǎng)孔中細(xì)菌的生長狀態(tài)良好，且差異較小。吸取一定量的菌液置于酶標(biāo)儀進(jìn)行OD600測量，結(jié)果顯示每個培養(yǎng)孔測得的OD600值差異較?。▓D1），經(jīng)統(tǒng)計分析，所有樣品的差異系數(shù)僅為8.0%。結(jié)果表明各個培養(yǎng)孔中的細(xì)菌生長一致性較好，成功建立了MsrA重組基因工程菌的微量培養(yǎng)體系。

圖1 96孔培養(yǎng)板細(xì)菌生長分析。虛線表示所有樣品的平均值

2.2 MsrA活性檢測體系的優(yōu)化

圖2 DTNB-DTT顯色法檢測MsrA重組蛋白酶活性。n=5，*表示與對照相比有統(tǒng)計學(xué)差異（<0.01）。

2.3 MsrA高通量活性篩選體系的確立

圖3 MsrA重組蛋白酶活性高通量檢測分析。虛線表示所有樣品的平均值

圖4 MsrA酶活性高通量篩選體系示意圖

3 討論

定向進(jìn)化技術(shù)是對生物酶進(jìn)行改造以提升其催化性能的有效手段，通過向模板序列中導(dǎo)入隨機(jī)突變，結(jié)合高通量篩選技術(shù)獲得期望的突變體[18]。和另一種常用的蛋白質(zhì)改造手段理性設(shè)計相比，定向進(jìn)化技術(shù)特別適合于對結(jié)構(gòu)與功能了解較少的蛋白質(zhì)進(jìn)行改造。理論上，通過大量反復(fù)的突變和篩選，任何蛋白質(zhì)都有可能得到進(jìn)化和優(yōu)化。但在實際操作中，對大量突變體樣本的篩選往往是此項研究工作的基礎(chǔ)和瓶頸[19-21]。因此，建立合適的高通量活性篩選體系是利用定向進(jìn)化技術(shù)對蛋白質(zhì)進(jìn)行改造的基礎(chǔ)。

本課題組前期通過一系列的篩選與優(yōu)化，獲得了能高效制備手性亞砜的生物酶MsrA[13]，課題組接下來需對該酶進(jìn)行定向進(jìn)化改造以進(jìn)一步提升其催化性能，為其將來的工業(yè)化應(yīng)用打下基礎(chǔ)。由于前期對MsrA酶活性的篩選主要是利用氣相色譜及高效液相色譜法檢測底物的消耗量或者產(chǎn)物的生產(chǎn)量[13]，耗時且效率低，不能滿足高通量大規(guī)模篩選的要求.。因此課題組便開展了MsrA酶活性高通量篩選體系的研究。根據(jù)文獻(xiàn)報導(dǎo)[17]，MsrA反應(yīng)體系中的DTT隨反應(yīng)的進(jìn)行而被消耗，由于DTT可和另一種物質(zhì)DTNB反應(yīng)生成黃色的化合物，該化合物在412nm處有最大光吸收。因此，測定反應(yīng)液在OD412處的光吸收變化情況，即可反映MsrA酶的催化活性。由于文獻(xiàn)中使用的是濃度較高的MsrA純酶，并不確定是否適用于MsrA粗酶液。特別是本研究的微量培養(yǎng)體系中，MsrA酶的含量非常低。因此，本研究在該方法基礎(chǔ)上進(jìn)行了進(jìn)一步的摸索和優(yōu)化。通過優(yōu)化重組菌株的培養(yǎng)方法以及顯色反應(yīng)體系，最終借助酶標(biāo)儀，實現(xiàn)了MsrA酶活性的高通量篩選。最終結(jié)果顯示，本研究測得不同培養(yǎng)孔中MsrA酶活性的一致性較好，能滿足后續(xù)酶定向進(jìn)化改造研究的高通量篩選需求。

綜上所述，本研究成功建立了適用于定向進(jìn)化改造的MsrA酶活性高通量篩選體系。