王寧 張帥民 王常元 徐賢剛 黎濤 王飛清 李克躍 劉振華

(1貴州省骨科醫(yī)院藥劑科，貴州 貴陽 550002；2貴州大學(xué)附屬人民醫(yī)院肝膽外科；3貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科)

原發(fā)性肝癌(PHC)是全世界最常見、排名第六位的癌癥，也是癌癥相關(guān)死亡的第四大常見原因〔1〕。肝癌術(shù)后常出現(xiàn)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，成為其高死亡率的主要原因之一，雖治療手段取得了極大進(jìn)步，但其療效仍不理想〔1,2〕。根本原因是缺乏防治肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的有效手段及確切的治療靶標(biāo)〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)ku80蛋白在多種腫瘤中異常表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞黏附、遷移及侵襲中發(fā)揮重要作用〔4～6〕，然而其在肝癌細(xì)胞系中表達(dá)、表達(dá)部位與肝癌細(xì)胞系的遷移、侵襲能力是否具有相關(guān)性仍不清楚。本文擬分析ku80蛋白表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞侵襲遷移能力的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞系MHCC97-H、MHCC97-L、HepG2和正常人肝細(xì)胞HL-7702購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，兔ku80單克隆抗體(EPR3467)、羊抗兔Alexafluor?488熒光標(biāo)記二抗均購(gòu)于艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。ku80引物由上海吉瑪生物技術(shù)公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MHCC97-H、MHCC97-L、HepG2、HL-7702使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，放置37℃、5%CO2孵箱中孵育，每2 d換培養(yǎng)基一次，細(xì)胞密度達(dá)到80%，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的處理。

1.2.2 Western印跡檢測(cè)蛋白水平 冰上裂解細(xì)胞30 min，收集裂解細(xì)胞懸液至1.5 ml離心管，14 000 r/min，4℃ 離心20 min。二喹啉甲酸(BCA)法定量各組樣品蛋白，用上樣緩沖液進(jìn)行樣品制備，上樣行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉常溫下封閉2 h，4℃冰箱中一抗孵育過夜，洗膜液洗3次，每次10 min，用二抗室溫孵育1.5 h，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色，化學(xué)發(fā)光及凝膠成像儀觀察各組細(xì)胞ku80蛋白水平。

1.2.3 Real-time(RT)PCR 提取各細(xì)胞系RNA，并使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。 篩選最有效的ku80引物序列為5′-TGACTTCCTGGATGCACTAATCGT-3′(正義鏈);5′-TTGGAGCCAATGGTCAGTCG-3′(反義鏈)。內(nèi)參β-actin正義鏈：5′-GGCGGCACCATGTACCCT-3′;反義鏈：5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′。LightCycler 480儀用于PCR(先95℃ 30 s，然后94℃ 30 s、30℃ 60 s、72℃ 30 s)，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。72℃延伸7 min，PCR在4℃終止。 使用LightCycler 480軟件1.5分析mRNA表達(dá)作為校準(zhǔn)物標(biāo)準(zhǔn)化比率。預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證目的基因擴(kuò)增效率與內(nèi)參一致。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 待細(xì)胞生長(zhǎng)至最佳，每孔3×105個(gè)/ml細(xì)胞接種于6孔板，次日長(zhǎng)滿后，用20 μl的加樣槍頭輕輕劃一痕，0 h、72 h時(shí)間點(diǎn)測(cè)量劃痕寬度算出細(xì)胞遷移率。

1.2.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) Transwell小室上層采用Matrigel膠與減血清培養(yǎng)基按1∶6比例混合，每孔100 μl鋪成單層，37℃溫箱孵育30 min； 每孔5×105個(gè)/ml，取300 μl細(xì)胞懸液接種于Transwell小室，置于24孔板中，下室加含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，用棉簽在小室內(nèi)層輕輕擦試膠，蘇木素染色10 min，伊紅紫染色8 min，75%酒精洗2次，每次2 min。隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞穿膜數(shù)。

1.2.6 免疫熒光檢測(cè)亞細(xì)胞定位 將爬好細(xì)胞的

玻片在培養(yǎng)板中用磷酸鹽緩沖液(PBS)浸洗細(xì)胞3次，每次3 min。4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min。用PBS(含0.2% 曲拉通X-100)通透20 min。以山羊血清非特異性封閉1 h。室溫下ku80一抗在濕盒中孵育2 h。二抗避光孵育細(xì)胞1 h。DAPI復(fù)染細(xì)胞5 min。PBS漂洗細(xì)胞后熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)處理 采用SPSS17.0軟件，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，行直線相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1 ku80 mRNA在各細(xì)胞系中的表達(dá)水平 ku80 mRNA在HL-7702和3株肝癌細(xì)胞MHCC97-H、MHCC97-L、HepG2中均可檢測(cè)到，并且3株肝癌細(xì)胞ku80 mRNA水平明顯高于正常肝細(xì)胞HL-7702(P<0.05，P<0.01)。見表1。

2.2 ku80蛋白在各細(xì)胞系中的表達(dá) ku80蛋白在正常肝細(xì)胞及3株肝癌細(xì)胞中均有表達(dá)，且相比正常肝細(xì)胞HL-7702,各肝癌細(xì)胞系ku80蛋白的表達(dá)升高明顯(P<0.05)，其中在MHCC97-H細(xì)胞中表達(dá)量最高(P<0.01)(圖1，表1)。

圖1 ku80蛋白在各細(xì)胞系中的表達(dá)

表1 各細(xì)胞系ku80的表達(dá)水平及侵襲遷移能力

與HL-7702比較：1)P<0.05，2)P<0.01

2.3 肝癌細(xì)胞體外遷移能力 相比正常肝細(xì)胞HL-7702,各肝癌細(xì)胞系具有明顯遷移能力(P<0.05)，其中MHCC97-H細(xì)胞在同時(shí)間內(nèi)遷移率與正常肝細(xì)胞比較差異更顯著(P<0.01)(表1，圖2)。

2.4 肝癌細(xì)胞體外侵襲能力 各細(xì)胞系均有不同程度侵襲能力。與正常肝細(xì)胞HL-7702相比，MHCC97-L、HepG2肝癌細(xì)胞系的穿膜細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，MHCC97-H細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)差異更顯著(P<0.01)(表1，圖3)。

2.5 ku80蛋白亞細(xì)胞定位 通過免疫熒光技術(shù)檢測(cè)MHCC97-H細(xì)胞中ku80的亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，綠色標(biāo)記的ku80蛋白主要在細(xì)胞核中表達(dá)，在細(xì)胞質(zhì)中亦有散在分布(圖4)。

2.6 ku80蛋白、mRNA表達(dá)量與肝癌細(xì)胞系遷移、侵襲能力的相關(guān)性分析 ku80蛋白水平與肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力呈正相關(guān)(r=0.83，F(xiàn)=50.03，P<0.01；r=0.94，F(xiàn)=159.70，P<0.01)；ku80 mRNA的表達(dá)水平亦與肝癌細(xì)胞系的遷移、侵襲性呈正相關(guān)(r=0.86，F(xiàn)=61.49，P<0.01；r=0.87，F(xiàn)=69.18，P<0.01)(圖5)。

圖2 肝癌細(xì)胞遷移能力(×40)

圖3 肝癌細(xì)胞侵襲能力(×100)

圖4 MHCC97-H細(xì)胞ku80免疫熒光亞細(xì)胞定位

圖5 ku80蛋白、mRNA表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞系遷移、侵襲能力的相關(guān)性

3 討 論

肝細(xì)胞性肝癌(HCC)往往合并肝硬化，對(duì)肝硬化患者進(jìn)行規(guī)律的超聲篩查可以有效地發(fā)現(xiàn)早期肝癌并有益于提高生存率〔7,8〕。外科治療如肝葉切除、肝移植、射頻消融、介入栓塞的治療有其各自的適應(yīng)證與局限性。研究發(fā)現(xiàn)輔以中醫(yī)中藥治療亦可收到一定效果〔9〕，索拉非尼一定程度上能使晚期肝癌患者的生存獲益〔10〕。然而，探索有效的治療藥物靶點(diǎn)，達(dá)到精準(zhǔn)治療，防治肝癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)是目前面臨的重要難題。

ku80是ku蛋白復(fù)合物的一個(gè)亞基，ku蛋白家族是在原核生物和真核生物中發(fā)現(xiàn)的豐富、高度保守的DNA結(jié)合蛋白，在維持基因組完整性中起重要作用〔11〕。ku80蛋白由XRCC5基因編碼，與 ku70共同構(gòu)成ku70/ku80異源二聚體，是一種DNA依賴性蛋白激酶復(fù)合物(DNA-PK)。ku80蛋白的顯著特征在于其作為“經(jīng)典”非同源末端連接(C-NHEJ)途徑中的初始DNA末端結(jié)合因子發(fā)揮中心作用，直接或間接地與幾種非同源末端連接因子和加工酶相互作用，作為整個(gè)DNA修復(fù)復(fù)合物的支架參與DNA雙鏈斷裂修復(fù)〔12,13〕。還有證據(jù)表明ku參與DNA損傷應(yīng)答機(jī)制的信號(hào)傳導(dǎo)，以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的激活和細(xì)胞凋亡的激活〔14〕。

ku的功能對(duì)于維持基因組完整性和適當(dāng)?shù)募?xì)胞和生物發(fā)育至關(guān)重要〔15〕。ku80作為ku發(fā)揮功能的重要亞基，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)ku80在肺癌組織中過表達(dá),在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，敲低ku80，可在體外和體內(nèi)抑制腫瘤特性〔16〕。肺腺癌的組織芯片免疫組織化學(xué)分析顯示ku80和環(huán)氧化酶(COX)-2水平與臨床病理特征之間存在強(qiáng)烈的正相關(guān)，ku80過度表達(dá)的肺癌患者預(yù)后不佳，ku80促進(jìn)COX-2表達(dá)和腫瘤生長(zhǎng)，并且可能是肺癌的潛在治療靶標(biāo)〔17〕。既往研究表明，DNA雙鏈斷裂修復(fù)蛋白ku80對(duì)順鉑聯(lián)合放射治療宮頸癌亦具有增敏作用〔18〕。熱療作為抗癌方法受到越來越多的關(guān)注，ku80可能通過影響細(xì)胞周期分布在高溫誘導(dǎo)的腎癌細(xì)胞凋亡和熱敏感性中發(fā)揮重要作用〔19〕。在局部進(jìn)展的食管癌研究中發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)ku80往往預(yù)示著更差的預(yù)后〔20〕。

總之，ku80可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。ku80蛋白主要在細(xì)胞核表達(dá)，其表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞系的遷移、侵襲能力呈正相關(guān)。鑒于ku80在腫瘤發(fā)展中的重要作用，有望成為肝癌的潛在治療靶標(biāo)。