楊 濤， 史 超， 艾尼娃爾·艾克木， 張向陽， 迪麗努爾·買買提依明

(1新疆醫(yī)科大學中心實驗室， 烏魯木齊 830011； 2新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院綜合心臟內科， 烏魯木齊 830054；3新疆醫(yī)科大學臨床研究院， 烏魯木齊 830011)

高原肺動脈高壓(high altitude pulmonary hypertension，HAPH)是指機體從平原環(huán)境進入高海拔地區(qū)后，在缺氧環(huán)境中誘導發(fā)生的肺血管病變，進而導致肺循環(huán)阻力升高[1-3]。在HAPH形成的初期，由于供氧不足引發(fā)肺微小血管發(fā)生收縮，隨著缺氧時間的延長，肺動脈出現(xiàn)平滑肌細胞肥大、管壁變厚、內徑變窄等改變，導致肺動脈壓(PAP)逐步上升，持續(xù)升高的PAP使心臟壓力負荷逐步上升，使得右心室增大、心室壁肥厚，隨著時間的推移，機體供氧不足造成心臟組織損傷，降低心輸出量，最終引發(fā)心衰[4-5]。目前在臨床中通常采用舒張血管或松弛平滑肌藥物(如：硝苯地平、氨茶堿等)緩解PAP癥狀。毛訶子為使君子科植物毗黎勒孔[Terminaliabillerica(Gaertn.)Roxb.]的干燥成熟果實[6]，主要化學成分為三萜皂苷、強心苷、木脂素、鞣質類、脂肪酸等[7]，具有抗氧化、降脂、抑菌等多種藥理作用[8-9]，研究表明由毛訶子組成的三果湯散對高原性疾病具有良好的治療作用[10-11]。本研究采用HAPH大鼠模型，探究毛訶子提取物對HAPH所致大鼠心臟損傷的保護作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器DW-86L338型超低溫冰箱(中國海爾公司)， Multiskan 352型酶標儀(美國賽默飛世爾科技公司)，Labsystems AC8型洗板機(美國賽默飛世爾科技公司)，TG16W型微量高速離心機(長沙維爾康湘鷹離心機公司)，BL-420電生理記錄儀(中國成都泰盟公司)，ks606731型小動物呼吸機(北京科思佳公司)，西北特殊環(huán)境人工實驗艙(新疆軍區(qū)總醫(yī)院)。

1.2 試藥硝苯地平片(山西云鵬制藥有限公司，批號 F160601)，毛訶子(新疆麥迪森維藥有限公司，批號 P30001307)，大鼠EPO ELISA 試劑盒 (中國臺灣亞諾法生技公司，批號 AD20180708)，大鼠C Reactive 蛋白ELISA試劑盒(上海艾博抗公司，批號 GR3184775-11)，大鼠IGF-1 ELISA 試劑盒(美國安迪公司，批號 P166960)，大鼠T-SOD ELISA 試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號 20180920)，大鼠MDA ELISA 試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號 20180919)，大鼠GSH-Px ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號 20180911)。

1.3 實驗動物清潔級SD大鼠50只，雌雄各半，體質量(170±10)g，購于新疆醫(yī)科大學動物中心，許可證號：SCXK(新)2016-0003。

1.4 HAPH模型建立隨機選取40只SD大鼠，放置于西北特殊環(huán)境人工實驗艙(氣壓：53.9 KPa)中30 d，建立HAPH模型；剩余10只SD大鼠，放置于新疆醫(yī)科大學動物中心平原環(huán)境中(氣壓：92.9 KPa)，所有大鼠自由飲水進食喂養(yǎng)30 d。

1.5 藥物的提取方法稱取毛訶子藥材1 kg，粉碎后過四號篩，用95%乙醇按照液料比1∶15 (g∶mL)、溫度60℃、時間1.5 h進行提取，提取液經濃縮、干燥，即得毛訶子醇提物。另稱取毛訶子藥材1 kg，粉碎后過四號篩，用蒸餾水按照液料比1∶15(g∶mL)、溫度60℃、時間1.5 h進行提取，提取液經濃縮、干燥，即得毛訶子水提物。

1.6 分組及給藥方法將40只HAPH模型SD大鼠隨機分為：高原肺動脈高壓組(生理鹽水0.4 mL/100 g體質量)、陽性組(硝苯地平片2.7 mg/kg體質量)、毛訶子醇提物組(毛訶子醇提物270 mg/kg體質量)和毛訶子水提物組(毛訶子醇提物270 mg/kg體質量)，平原環(huán)境中的10只大鼠為平原組(生理鹽水0.4 mL/100 g體質量)，各組大鼠自由進食飲水，連續(xù)灌胃15 d。

1.7 大鼠肺動脈血壓的測定[12]給藥完成24 h后，采用戊巴比妥鈉將各組大鼠麻醉后，以平臥狀態(tài)固定于手術臺，打開胸腔，充分暴露肺和心臟，分離頸靜脈，插管經右心房、右心室進入肺動脈，測定肺動脈血壓，記錄血壓結果。

1.8 大鼠血清中CRP、IGF-1和EPO含量的測定各組大鼠腹主動脈取血，按試劑盒說明方法操作，測定大鼠血清中C-反應蛋白(CRP)、促生長因子(IGF-1)和促紅細胞生成素(EPO)的含量。

1.9 大鼠心臟組織中MDA、SOD和GSH-PX含量的測定摘取各組大鼠心臟，按照試劑盒說明方法對心臟組織進行處理，測定心臟組織中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的含量。

1.10 大鼠心臟組織病理學檢查取“1.9”項下大鼠心臟組織，置于固定液中固定，使用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，蘇木精-伊紅染色(HE)，置于顯微觀察各組大鼠心臟組織的形態(tài)變化。

2 結果

2.1 各組大鼠肺動脈血壓測定結果與平原組比較，高原肺動脈高壓組、陽性組、毛訶子醇提物組、毛訶子水提物組大鼠肺動脈血壓升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與高原肺動脈高壓組比較，陽性組、毛訶子醇提物組大鼠肺動脈血壓下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與陽性組比較，毛訶子水提物組、毛訶子醇提物組大鼠肺動脈血壓升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠肺動脈壓測定結果

注：與平原組比較，*P<0.05； 與高原肺動脈高壓組比較，#P<0.05；與陽性組比較，★P<0.05。

2.2 各組大鼠血清CRP、IGF-1、EPO含量的測定結果與平原組比較,高原肺動脈高壓組、陽性組、毛訶子醇提、水提物組大鼠血清中CRP含量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與高原肺動脈高壓組比較,陽性組、毛訶子醇提物組、毛訶子水提物組大鼠血清中CRP含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與陽性組比較, 毛訶子醇提物組、毛訶子水提物組大鼠血清中CRP含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與平原組比較,高原肺動脈高壓組、毛訶子醇提物組、毛訶子水提物組大鼠血清中IGF-1含量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；陽性組大鼠血清中IGF-1含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與高原肺動脈高壓組比較,陽性組大鼠血清中IGF-1含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；毛訶子醇提物組、毛訶子水提物組大鼠血清中IGF-1含量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與陽性組比較，毛訶子醇提物組、毛訶子水提物組大鼠血清中IGF-1含量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與平原組比較,高原肺動脈高壓組、陽性組、毛訶子醇提物組、毛訶子水提物組大鼠血清中EPO含量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與高原肺動脈高壓組比較,陽性組、毛訶子醇提物組、毛訶子水提物組大鼠血清中EPO含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與陽性組比較,毛訶子醇提物組大鼠血清中EPO水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠血清中CRP、IGF-1、EPO含量的測定結果

注：與平原組比較，*P<0.05； 與高原肺動脈高壓組比較，#P<0.05；與陽性組比較，★P<0.05。

2.3 各組大鼠心臟病理學檢查結果平原組大鼠在低、高倍視野下可見心肌結構均正常，心肌細胞染色清楚，細胞核致密，心肌纖維排列整齊，橫紋清楚，未見顆粒樣變、嗜酸性病變細胞浸潤等異常病變情況(圖1A，圖1B)。高原肺動脈高壓組大鼠在低倍視野下可見心肌纖維排列混亂、橫紋不清(圖1C)，在高倍視野下可見心肌纖維呈顆粒樣病變并少量嗜酸性病變，心肌間質血管明顯擴張充血，偶見炎性細胞浸潤(圖1D)。陽性組大鼠在低倍視野下可見心肌纖維排列不規(guī)則，橫紋不清(圖1E)，在高倍視野下可見少量大鼠心肌纖維輕度顆粒樣變，偶見心肌間質血管輕度擴張充血(圖1F)。毛訶子醇提物組大鼠在低倍視野下可見心肌間質血管明顯擴張充血(圖1G)，在高倍視野下可見心肌纖維輕度腫脹，心肌細胞嗜酸性病變，少量炎細胞浸潤(圖1H)。毛訶子水提物組大鼠在低倍視野下可見心肌纖維排列不規(guī)則，橫紋不清(圖1I)，在高倍視野下可見大鼠心肌纖維顆粒樣變形并少量嗜酸性病變細胞浸潤，部分心肌間質血管擴張充血并偶見炎性浸潤(圖1J)。

2.4 各組大鼠心臟SOD、MDA、GSH-Px的測定結果與平原組比較，高原肺動脈高壓組、陽性組、毛訶子醇提物組、毛訶子水提物組大鼠心臟中SOD、GSH-Px活性降低，MDA含量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與高原肺動脈高壓組比較，陽性組、毛訶子醇提物組、毛訶子水提取組大鼠心臟組織中SOD、GSH-Px活性增強，MDA含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與陽性組比較，毛訶子醇提物、毛訶子水提物組心臟中SOD、GSH-Px活性增強，MDA含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

A 平原組(HE×100)

B 平原組(HE×400)

C高原肺動脈高壓組(HE×100)

D高原肺動脈高壓組(HE×400)

E 陽性組(HE×100)

F陽性組(HE×400)

G毛訶子醇提物組(HE×100)

H毛訶子醇提物組(HE×400)

I 毛訶子水提物組(HE×100)

J 毛訶子水提物組(HE×400)

圖1 各組大鼠心臟病理學檢查顯微圖

3 討論

海拔在2 500 m以上的地區(qū)稱為高原地區(qū)[13]。全球大約有超過1億人生活在高原地區(qū)，主要分布在我國的青藏高原、帕米爾高原以及南美洲的玻利維亞高原等。初次進入高原者，由于機體持續(xù)處于缺氧狀態(tài)從而刺激外周化學感受器(頸動脈竇)，進而刺激呼吸中樞引起早期通氣量增加，機體可吸入更多氧氣已進行代償，此過程稱為高原習服，即人體對高原低氧的適應過程。當初登高原者，發(fā)生高原習服失敗時，則會引起高原紅細胞增多癥、高原肺動脈高壓癥[14-15]。本研究通過西北特殊環(huán)境人工實驗艙模擬海拔5 000 m高原環(huán)境，建立高原肺動脈高壓模型大鼠。實驗結果顯示，與平原環(huán)境大鼠相比，高原環(huán)境大鼠肺動脈血壓增高，給予硝苯地平干預后，肺動脈壓降低，表明高原肺動脈高壓大鼠模型建立成功。

表3 各組大鼠心臟SOD、MDA、GSH-Px的測定結果

注：與平原組比較，*P<0.05； 與高原肺動脈高壓組比較，#P<0.05； 與陽性組比較，★P<0.05。

活性氧(ROS)為一類廣泛存在生物體中富含有氧元素的物質，并且具有活潑的性質，如：激發(fā)態(tài)的氧分子、過氧化物、含氧自由基[16]。在正常機體內，ROS的產生和消耗維持在平衡狀態(tài)，當機體受到某些內因或者外部因素刺激后，機體發(fā)生代謝紊亂，使ROS產生過多或利用減少，過剩的ROS可造成細胞膜氧化損傷，最終導致多種組織出現(xiàn)氧化應激損傷。有證據表明，高原環(huán)境下帶來的低氧誘導了ROS的過載[17]，過載的ROS最終導致HPH的發(fā)生[18]。當機體暴露于高海拔環(huán)境中時，血液中含氧量下降，機體處于氧化應激狀態(tài)，氧化損傷產物蛋氨酸亞砜、MDA等的含量增加， SOD、GSH-Px等內源性抗氧化酶活性降低。本研究結果顯示，高原肺動脈高壓組大鼠心肌內SOD、GSH-Px活性減弱，MDA的含量增加，這表明HAPH大鼠處在氧化應激狀態(tài)，并且出現(xiàn)心臟的損傷。給予毛訶子(醇、水)提取物進行干預，HAPH大鼠心組織內SOD、GSH-Px活性增強， MDA的含量降低，這表明不同溶媒毛訶子的提取物，均可改善HAPH大鼠的氧化應激狀態(tài)，減輕心臟的氧化損傷程度。

機體長期處于高海拔區(qū)域，慢性低氧會直接刺激機體系統(tǒng)性炎癥的發(fā)生。CRP[19]是重要的炎癥介質，其水平不僅可作為組織受損程度的判斷依據，還可以作為心血管疾病的危險因子。同時，CRP可通過直接損傷血管內皮細胞、促進ET-1 的分泌，降低NOS的水平，誘導內皮細胞功能紊亂使肺血管痙攣從而參與HAPH的形成。促紅細胞生成素(EPO)為機體中內源性糖蛋白激素[20]，可促使紅細胞產生。當機體長期處于高原環(huán)境時，低氧能夠刺激機體產生大量EPO，與靶器官結合后，可通過激活JAK2及STAT-5相關信號傳導途徑，進而誘導紅細胞大量增殖，導致血液黏稠度增加、微循環(huán)障礙、血栓的形成、廣泛的臟器損傷。IGF-1亦被稱作促生長因子，是一類蛋白多肽，是一種具有心血管保護作用的細胞因子[21]。研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1可通過多種途徑，舒張血管、消除多余氧自由基等。本實驗結果顯示：HAPH大鼠血清中CRP 、EPO含量升高，IGF-1含量降低，給予毛訶子水提取物、醇提取物干預后，大鼠血清中以上指標都趨向正常水平,表明毛訶子水提取物、醇提取物對HAPH大鼠的心臟損傷具有保護作用。