李永麗，閆作炳，周洲，張永安，曲良建

(1.河南科技大學林學院，河南 洛陽 471003；2.中國林業(yè)科學研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所，北京 100091)

利尿激肽Helicokinin I(YFSPWG-NH2)是從美洲棉鈴蟲Helicoverpa zea(Boddie)大腦中分離提取的一種小分子昆蟲神經肽，屬昆蟲激肽(Insect kinins)家族的一員。Seinsche 等證實將利尿激肽Helicokinin I 作用于煙芽夜蛾Heliothis virescens幼蟲能顯著抑制其體重增加，并發(fā)現糞便中水分排泄的增加，以及在幼蟲中誘導出饑餓信號，導致能量儲存和營養(yǎng)消化效率的降低[1]。已有研究證實極微量的利尿激肽 Helicokinin I 或其類似物注入昆蟲體內，可顯著增加其體內液體排泄，并誘導饑餓反應、消化酶釋放抑制等生理代謝變化，導致試蟲的體重減輕甚至死亡[1-3]。昆蟲神經肽來源于生物體，具有對高等生物和環(huán)境安全等優(yōu)點，是一種極具應用潛力的天然殺蟲活性物質，對其開展應用技術的研究可為害蟲治理提供思路。

利尿激肽Helicokinin I 作為一種短肽類殺蟲物質用于害蟲治理時，首先要保證其在環(huán)境中的穩(wěn)定性，其次還要滿足該物質能夠穿透昆蟲體壁或者通過消化道順利進入蟲體進而發(fā)揮作用，這是目前昆蟲神經肽在害蟲治理應用中亟待解決的技術問題。利尿激肽Helicokinin I 直接穿過昆蟲體壁角質而進入蟲體內難度較大，通過昆蟲的取食行為使該神經肽經消化道進入蟲體內發(fā)揮活性是一種更可行的方法，但如何有效解決昆蟲消化道酶對外源神經肽的降解是其應用中必須要解決的問題。

穿膜肽 TAT (transactivator of transcription，TAT)為HIV 病毒有效轉錄和復制所必須的多肽序列[4]，TAT 蛋白轉導域能將與之共價連接的生物大分子(如核酸、多肽、蛋白質等)非特異地轉導至細胞內部，這種過程既不依賴于受體和轉運蛋白，也與溫度和能量無關，而且對宿主細胞幾乎沒有毒性[5-8]。已有研究表明，細胞穿膜肽TAT 能夠攜帶與之融合的昆蟲神經肽滯育激素(diapause hormone，DH)經舞毒蛾Lymantria dispar(Linnaeus)幼蟲取食途徑實現融合蛋白TAT-DH 在幼蟲體內的跨膜轉導到達其他組織，且該過程與融合蛋白的攝入量成比例[9]。為探明Helicokinin I 對舞毒蛾的活性與應用潛力，在完成TAT-Helicokinin I 融合肽合成與分析的基礎上，筆者于2016年7—8月在河南科技大學林業(yè)生物技術實驗室測試了利尿激肽Helicokinin I 和融合肽TAT-Helicokinin I 對舞毒蛾幼蟲注射活性，比較二者經取食途徑進入蟲體后對舞毒蛾幼蟲生長的影響，以期為今后深入研究利尿激肽Helicokinin I 在害蟲治理中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 C 末端乙醛化的3 種多肽TAT、Helicokinin I 和 TAT-Helicokinin I 由上海生工生物工程有限公司合成，經高效液相色譜(HPLC)純化后純度達99%，氨基酸序列經質譜法(mass spectrometry)分析正確；TAT 多肽氨基酸編碼序列為YGRKKRRQRRR，Helicokinin I 多肽氨基酸編碼序列為YFSPWG，TAT-Helicokinin I 多肽氨基酸編碼序列為YGRKKRRQRRRYFSPWG；舞毒蛾幼蟲及其人工飼料由中國林業(yè)科學研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所昆蟲病原微生物研究室提供。

1.2 3 種多肽對舞毒蛾幼蟲注射活性測試 將TAT、Helicokinin I 和 TAT-Helicokinin I 多肽干粉分別溶于無菌超純水中，每種多肽設置1.5，15，150 μmol/L 3 個濃度，多肽溶液現配現用。2016年7月，挑選生長一致的舞毒蛾3 齡末期幼蟲，用微量注射器分別將配置好的多肽溶液緩慢注入幼蟲體內。每頭幼蟲注射4 μL 多肽溶液，即每種多肽注射幼蟲分別達到 6，60，600 pmol /頭；對照組(CK)注射4 μL 無菌水。每個濃度處理試蟲20 頭，每個處理重復3 次。注射方法參照 Seinsche 等[1]略加改動，將4 μL 多肽水溶液或無菌水從蟲體背面距尾部第3 至第4 對毛瘤之間緩慢注入。注射后將試蟲放置于人工飼料上自由取食，試蟲于培養(yǎng)箱中單頭飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度設置26 ℃；每隔24 h 稱量試蟲體質量，并記錄幼蟲死亡數。

1.3 2 種多肽對舞毒蛾幼蟲飼喂活性測試 將Helicokinin I 和 TAT-Helicokinin I 多肽干粉分別溶解于無菌超純水中，分別將其配置成20，60 μmol/L 2種濃度，多肽溶液現配現用。2016年8月，吸取200 μL的多肽水溶液滴加在每瓶飼料表面，用涂布器涂抹均勻后自然晾干5 min 后備用；對照組(CK)每瓶飼料表面涂抹200 μL 無菌水，自然晾干5 min后備用。每瓶飼料放入1 頭試蟲，自由取食，試驗共5 個組，每個處理20 頭幼蟲，每個處理重復3 次；每隔24 h 稱量試蟲體質量，并記錄幼蟲死亡數。

2 結果與分析

2.1 3 種多肽對舞毒蛾幼蟲的注射活性 在注射無菌水后對照組試蟲繼續(xù)正常生長，注射TAT 后試蟲生長亦不受影響，注射TAT-Helicokinin I 和Helicokinin I 對舞毒蛾幼蟲均表現出注射毒性，且TATHelicokinin I 比Helicokinin I 表現出更高的生物活性。60，600 pmol/頭劑量的 TAT-Helicokinin I 和Helicokinin I 對試蟲均表現出致死性，試蟲死亡發(fā)生在注射48 h 內，超過48 h 后死蟲數量增加不明顯，6 pmol/頭的低劑量對試蟲生長沒有影響；注射600 pmol/頭的融合肽TAT-Helicokinin I 后，舞毒蛾幼蟲 24，48，72 h 的校正死亡率分別為 36.8%，57.9%，57.9%，而注射600 pmol/頭的Helicokinin I肽后，舞毒蛾幼蟲24，48，72 h 的校正死亡率分別僅為10.5%，15.8%，21.1%，其生物活性顯著低于融合肽TAT-Helicokinin I(表1)。

2.2 2 種多肽對舞毒蛾幼蟲的取食活性 飼喂Helicokinin I濃度為 20，60 μmol/L 的處理組舞毒蛾幼蟲與對照組在體質量增長上無顯著差異，而飼喂TAT-Helicokinin I 的處理組舞毒蛾幼蟲體質量增長明顯低于對照組。當 TAT-Helicokinin I 濃度為60 μmol/L時，對舞毒蛾幼蟲生長表現出顯著抑制作用，取食2 d后幼蟲平均體質量為100.2 mg，顯著低于對照組取食2 d 后平均體質量115.3 mg(圖1)。

表1 3 種多肽不同劑量注射舞毒蛾幼蟲的死亡率

圖1 2 種多肽不同濃度飼喂對舞毒蛾幼蟲體質量增長的影響

3 討論

已有研究表明，穿膜肽TAT 對細胞幾乎沒有毒性[5-6]，本研究中注射TAT 對舞毒蛾幼蟲沒有毒性，進一步驗證和證實了該結論。注射TAT-Helicokinin I 和Helicokinin I 則對舞毒蛾幼蟲均表現出活性，且TAT-Helicokinin I 的生物活性更高，其原因可能源于TAT 高效跨膜轉導，增加了融合肽TAT-Helicokinin I 的穩(wěn)定性，從而對舞毒蛾幼蟲表現出較高的致死效應。Seinsche 等[1]在煙芽夜蛾的研究中發(fā)現，幼蟲體內注射50 pmol 的Helicokinin I 可表現出致死性，本研究中筆者亦發(fā)現該多肽60 pmol/頭的劑量可對舞毒蛾幼蟲表現出致死性，但6 pmol/頭的劑量對試蟲生長無影響。

利用幼蟲注射的方法雖然能夠證實利尿激肽Helicokinin I 對靶標害蟲的生物活性，但該方法難以在害蟲治理中應用。若能利用害蟲的取食行為，使外源融合肽TAT-Helicokinin I 經消化道跨膜運輸進入蟲體而發(fā)揮生物活性，則不失為一種更可取的方法。本研究中的喂食試驗顯示，融合肽TAT-Helicokinin I 對舞毒蛾幼蟲體質量增長產生顯著抑制作用，而Helicokinin I 則不具有類似活性，進一步證明了融合肽TAT-Helicokinin I 的高效跨膜轉導作用和穩(wěn)定性。試驗中飼喂?jié)舛葹?0 μmol/L 的融合肽TAT-Helicokinin I 時，并未造成試蟲死亡，其原因一方面可能是飼喂TAT-Helicokinin I 的量還比較低，另一方面也可能是因為TAT 與Helicokinin I 融合后仍存在部分被消化道酶降解的可能。因此，研發(fā)更加高效的細胞穿膜肽，或者在融合肽TAT-Helicokinin I 基礎上進一步研究增加抑制消化酶的高效基因，將對促進利尿激肽在害蟲治理中的應用具有重要作用。此外，嘗試通過轉基因技術，闡明融合肽TAT-Helicokinin I 在植物中的表達量和生物活性亦對該神經肽的應用具有積極意義。

本文作者對利尿激肽Helicokinin I 的生物活性進行測定，通過其與細胞穿膜肽TAT 有效融合后經昆蟲取食途徑應用于害蟲防治的設想進行了初步探索，研究結果可為今后Helicokinin I 在害蟲治理中的應用提供理論和實驗參考，為其他昆蟲小分子神經肽的在害蟲治理中的應用研究提供借鑒和思考；研究中設計的氨基酸序列亦可為今后新型殺蟲基因研究和應用提供依據。