胡振亮，靳軒，龐久帥，王雪菲，陳孟，李會平

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河北省林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點實驗室，河北 保定 071000)

油松枯梢病是一種嚴(yán)重危害油松Pinus tabulaeformis健康的病害，其主要癥狀為油松枝梢干枯，針葉灰白且不落的現(xiàn)象。該病害于2004年在河北秦皇島市北戴河聯(lián)峰山公園首次發(fā)現(xiàn)，隨著該病的逐年加重，到2014年發(fā)病率已達(dá)70 %以上，給當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟及生態(tài)景觀造成了極大影響。之后該病害又在保定易縣清西陵、承德避暑山莊等地被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。李會平，王婧等確定該病害的病原菌為半知菌亞門Deuteromycotina 腔孢綱 Coelomycetes 球殼孢目Sphaeropsidales 球殼孢科 Sphaeropsidaceae 球殼孢屬SphaeropsisSacc.的球殼孢菌Sphaeropsis sapinea，且首次明確油松為該病原的自然感染寄主[1-2]。任曉婧等對油松枯梢病病原菌越冬及入侵途徑進(jìn)行了研究，確定了該病原菌的入侵途徑和越冬方式[3]。2014年和2015年北戴河區(qū)政府對聯(lián)峰山油松主要病蟲害進(jìn)行了連續(xù)兩年的航空化學(xué)防治工作，油松枯梢病得到明顯控制，防治后新梢年生長量明顯增長[4]。雖然采用化學(xué)防治在一定程度上控制了該病害的進(jìn)一步擴展，但眾所周知，化學(xué)農(nóng)藥在生產(chǎn)中的大量使用會對環(huán)境造成極大破壞，而且化學(xué)農(nóng)藥在殺死病原菌的同時，也會殺死環(huán)境中的有益微生物。因此，尋找對環(huán)境友好的化學(xué)農(nóng)藥替代品已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人類可持續(xù)發(fā)展的迫切要求。生物防治作為一種行之有效的手段，已日益受到人們的重視。

植物內(nèi)生菌是生活于健康植物的組織和器官內(nèi)部的真菌或細(xì)菌，具有穩(wěn)定的生存空間，不受外界環(huán)境影響等特點。有益的植物內(nèi)生菌可以有效地防病殺蟲、促進(jìn)植物生長，已成為生物防治中有潛力的微生物農(nóng)藥；它們不僅可以用來防治病蟲害，而且在幫助植物本身抵抗不良環(huán)境及生物固氮等方面有著重要的生態(tài)和生理作用[5-8]。近年來，植物內(nèi)生菌作為一種生防資源，已經(jīng)成為被廣泛關(guān)注的研究熱點。很多研究學(xué)者對一些生防菌的生物學(xué)特性進(jìn)行深入研究后，對其加以開發(fā)應(yīng)用。郭睿文等從獼猴桃篩選出拮抗菌，對獼猴桃潰瘍病病原菌有較強的抑制作用[9]；王美琴等在番茄中篩選出對番茄灰霉病菌和葉霉病菌有拮抗作用的菌株[10]；陳振明 等從紅樹林分離內(nèi)生細(xì)菌并篩選出對枯萎病菌、炭疽病菌及番茄青枯病菌具有較強抑制作用的拮抗菌，且部分內(nèi)生菌對番茄生長有促進(jìn)作用[11]。但關(guān)于油松內(nèi)生細(xì)菌的報道較少，本試驗主要從油松的植物組織中分離內(nèi)生細(xì)菌，篩選出對油松枯梢病具有拮抗作用的菌株，以期為油松枯梢病防治提供生防菌株和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 材料來源 內(nèi)生細(xì)菌分離用油松松針、松枝、根均于2017年6月和10月采自河北省秦皇島市聯(lián)峰山公園。

油松枯梢病病原菌S.sapinea從采自聯(lián)峰山公園發(fā)病區(qū)的油松枯梢病的病枝中分離，純化，保存?zhèn)溆?，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林木病理實驗室提供。

盆栽試驗用5 a 生健康油松苗于2018年6月購買自河北省洪崖山國有林場。

1.1.2 培養(yǎng)基 內(nèi)生細(xì)菌分離和培養(yǎng)采用LB 培養(yǎng)基，病原真菌的培養(yǎng)和拮抗試驗采用PDA 培養(yǎng)基。LB 培養(yǎng)基，PDA 培養(yǎng)基參照裴淑蘭 等人的配置方法[12]。

1.2 試驗方法

1.2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離與純化 在河北省秦皇島市聯(lián)峰山公園，選取3 株30 a 生健康油松，對其1 a生松針、2 a 生松針、1 a 生松枝(韌皮部、木質(zhì)部)、2 a生松枝(韌皮部、木質(zhì)部)、根(毛細(xì)根)等7 個部位進(jìn)行采樣，共3 個重復(fù)，塑封袋帶回實驗室，標(biāo)記后置于4 ℃冰箱保存。用無菌水沖洗植物組織表面，清洗掉表面雜物，晾干后，松針剪成10 mm 長的段狀，莖部和根部均剪成2.5 mm 長段狀，稱重后表面消毒。先用75%酒精浸泡30 s，再用0.1%升汞消毒3～5 min，無菌水漂洗5 次，將最后一次沖洗液涂布于平板以檢測表面消毒是否徹底。表面消毒完畢后，用消毒后的剪刀和鑷子將其剪碎，放入滅菌研缽內(nèi)，加入滅菌后的石英砂進(jìn)行研磨，然后置于已經(jīng)滅菌并加入9 mL 蒸餾水的試管中，在搖床上175 r/min，30 ℃，震蕩30 min，形成均勻的植物組織溶液。將植物組織溶液加無菌水稀釋10 倍，再依次稀釋5 次，將各濃度梯度的稀釋液均取100 μL，分別涂布于 LB 平板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)[13-15]。培養(yǎng)1 d 后，觀察菌落生長情況，以形態(tài)特征為判斷依據(jù)。挑取單個菌落接種于LB 平板上進(jìn)行純化，以獲得單一菌種。然后采用50%甘油懸液保藏法，-80 ℃保存菌種。

1.2.2 拮抗菌的篩選 初篩，采用平板對峙法，以油松枯梢病病原菌為靶標(biāo)，分別在含有25 mL 的PDA 平板(直徑90 mm)中央放置生長旺盛的油松枯梢病病原菌菌碟(直徑6 mm)，在其四周接種生長旺盛的內(nèi)生菌菌碟，每個菌碟距離病原菌中心2.6 cm，每個處理重復(fù)3 次，以平板中心僅放病原菌菌碟為對照，28 ℃恒溫培養(yǎng)，每天測量處理組和對照組菌落半徑，計算抑菌率。

復(fù)篩，將經(jīng)過初篩獲得的的菌株再次轉(zhuǎn)接入LB平板上活化，1 d 后將菌株接種于LB 液體培養(yǎng)基中，160 r/min，37 ℃搖床培養(yǎng) 24 h；然后將培養(yǎng)液8 000 r/min，4 ℃，離心 5 min；取上清液，用 0.2 μm微孔濾膜過濾備用。在PDA 平板中央接種油松枯梢病病原菌菌碟，并在距離平板中心2.6 cm 處用打孔器打2 個孔，然后將菌株發(fā)酵上清液50 μL 注入孔內(nèi)，3 個重復(fù)，以孔內(nèi)注射LB 液體培養(yǎng)基為對照組，28 ℃恒溫培養(yǎng)，每天測量處理組和對照組菌落半徑，計算抑菌率[16-18]。

1.2.3 拮抗菌AM-5 對油松枯梢病病原菌孢子萌發(fā)的影響 將拮抗菌在LB 培養(yǎng)基上活化，培養(yǎng)1 d后，用無菌水沖洗菌落，借助分光光度計，根據(jù)濃度關(guān)系曲線，將菌懸液配成1 ×108cfu/mL 的濃度。油松枯梢病病原菌孢子由采集的發(fā)病松針中獲得，孢子懸浮液配備參照任曉婧 等方法[19]，用血球計數(shù)板計數(shù)，將孢懸液配成1 ×106個/mL 的濃度。將AM-5 菌懸液和病原菌孢子懸浮液以1 ∶1 混合(2 mL∶2 mL)于無菌離心管中，以等體積無菌蒸餾水為對照，3 個重復(fù)，黑暗25 ℃分別放置2，12，24 h后進(jìn)行鏡檢，每個載玻片觀察5 個視野，以萌發(fā)出的芽管長度大于孢子短軸一半時記為萌發(fā)，記錄孢子萌發(fā)數(shù)量，計算孢子萌發(fā)率[1，20-21]。

孢子萌發(fā)率(%) ＝孢子萌發(fā)數(shù)/孢子總數(shù)×100

1.2.4 拮抗細(xì)菌鑒定

1.2.4.1 菌體形態(tài)、培養(yǎng)特征觀察及生理生化指標(biāo)測定 將拮抗菌株AM-5 劃線接種于LB 培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并描述其形態(tài)特征，同時取少量菌落進(jìn)行革蘭氏染色及芽孢染色等，具體操作方法參照方中達(dá)等人[22]，并參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進(jìn)行生理生化鑒定，另外，部分生理生化項目由青島科創(chuàng)質(zhì)量檢測有限公司進(jìn)行鑒定。

1.2.4.2 16S rDNA 序列分析鑒定 菌株AM-5總DNA 的提取采用DNA 提取試劑盒，購自上海桑尼生物科技有限公司。PCR 擴增采用細(xì)菌通用引物 27F(5′- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)。

反應(yīng)體系50 μL 包含:基因組 DNA(20 ng/μL)1.0 μL，Buffer 5.0 μL，Taq 酶 1.0 μL，dNTP 1.0 μL，引物 27F(10 μM)1.5 μL， 引物 1492R(10 μM)1.5 μL，ddH2O 39.0 μL。PCR 擴增反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min， 95 ℃變性30 s， 58 ℃退火30 s，72 ℃復(fù)性90 s，共 35 個循環(huán)，最后 72 ℃延伸7 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后交上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測序。將測得序列在NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行16S rDNA 序列同源性比較，然后用軟件MEGA 5.0 以鄰位法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.2.5 盆栽試驗

1.2.5.1 拮抗菌懸浮液及病原菌孢子懸浮液的配備 將拮抗菌AM-5 從冷凍冰箱取出，待解凍后，采用涂布平板法在LB 平板上活化拮抗菌株，培養(yǎng)5-10皿備用；待培養(yǎng)出菌落后，超凈臺中用無菌水沖洗菌落，移液槍吸沖多次使菌懸液充分混勻，制成細(xì)菌懸浮液，然后利用分光光度計，根據(jù)濃度關(guān)系曲線，將細(xì)菌懸浮液配成1 ×108cfu/mL 的濃度。油松枯梢病病原菌孢子由采集的發(fā)病松針中獲得，孢子懸浮液配備參照任曉婧 等方法[19]，將孢懸液配成 1 ×106個/mL 的濃度。

1.2.5.2 拮抗菌AM-5 對油松枯梢病的預(yù)防試驗取10 株健康且長勢一致的5 a 生油松苗，每棵苗選擇3 個長勢一致的側(cè)枝，每個側(cè)枝標(biāo)記50 個松針用于試驗。處理組為先接種濃度為1 ×108cfu/mL的拮抗菌懸浮液，2 h 后接種濃度為1 ×106個/mL病原菌孢懸液；對照組為先接種無菌水后接種病原菌的處理(無菌水+病原菌)和單獨接種拮抗菌的處理為對照，測定該拮抗菌對油松枯梢病的預(yù)防作用。每個處理設(shè)置10 個重復(fù)。病原菌和拮抗菌均采用浸泡法接種，將松針完全浸在已配好的拮抗菌菌懸液或病原菌孢懸液中30 s，用塑料袋罩上接種植株進(jìn)行保濕處理48 h。將處理后的油松苗置于25 ℃室溫培養(yǎng)，每天觀察發(fā)病情況，14 d 后統(tǒng)計發(fā)病率，計算預(yù)防效果。

發(fā)病率(%) ＝發(fā)病松針/調(diào)查總松針數(shù)×100

預(yù)防效果(%) ＝(對照組發(fā)病率-處理組發(fā)病率)/對照組發(fā)病率×100

1.2.5.3 拮抗菌AM-5 對油松枯梢病的防治試驗取10 株健康且長勢一致的5 a 生油松苗，每棵苗選擇2 個長勢一致的側(cè)枝，每個側(cè)枝標(biāo)記50 個松針用于試驗。處理組為先接種濃度為1 ×106個/mL的病原菌孢懸液，7 d 后統(tǒng)計發(fā)病率[19]，然后接種濃度為1 ×108cfu/mL 的拮抗菌懸浮液，3 d 后再接1次拮抗菌懸浮液。對照組為先接種病原菌孢懸液后接種無菌水。每個處理設(shè)置10 個重復(fù)。拮抗菌和病原菌接種方式均同預(yù)防試驗。將處理后的油松苗置于25 ℃室溫培養(yǎng)，每天觀察病害發(fā)展情況，14 d后再次統(tǒng)計發(fā)病率，計算防治效果。

防治效果(%) ＝(對照組發(fā)病率增加值-處理組發(fā)病率增加值)/對照組發(fā)病率增加值×100

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 用Excel 軟件對統(tǒng)計結(jié)果進(jìn)行計算和作圖，用SPSS 軟件進(jìn)行顯著性方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌的分離與篩選 根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、大小、表面光滑度等，從油松不同組織中共分離并純化得到內(nèi)生細(xì)菌40 株。分別從健康油松1 a生松針、2 a 生松針、1 a 生松枝韌皮部、1 a 生松枝木質(zhì)部、2 a 生松枝韌皮部、2 a 生松枝木質(zhì)部、根，分離到內(nèi)生細(xì)菌 3，8，4，6，5，6，8 株。以油松枯梢病菌為指示菌，通過平板對峙培養(yǎng)，篩選出3 株拮抗作用較強的菌株，編號分別為AZ-3(分離于1 a 生松針)，QZ-3(分離于2 a 生松針)，AM-5(分離于 1 a 生松枝木質(zhì)部)，菌株的抑菌率分別為 39.72%，31.83%，66.95%；在拮抗菌發(fā)酵液對峙試驗中，菌株AM-5 的發(fā)酵液對油松枯梢病病原菌的生長有一定抑制作用，為27.89%(圖1，表1)。

圖1 拮抗菌AM-5 及其發(fā)酵液與油松枯梢病病原菌對峙培養(yǎng)3 d 菌落形態(tài)

表1 不同拮抗菌及其發(fā)酵液3 d 時對油松枯梢病病原菌的抑制作用

2.2 拮抗菌AM-5 對油松枯梢病病原菌孢子萌發(fā)的影響 無菌水處理的病原菌孢子2，6，12 h 后萌發(fā)率分別為34%，9.33%，49.67%，當(dāng)無菌水持續(xù)處理至24 h 時，其萌發(fā)率達(dá)72.33%；與對照組相比，拮抗菌菌懸液處理的病原菌孢子萌發(fā)率顯著降低，當(dāng)用菌懸液持續(xù)處理至24 h時，其萌發(fā)率僅為30.5%，說明拮抗菌菌懸液對病原菌孢子萌發(fā)具有顯著的抑制作用(表2)。

表2 拮抗菌AM-5 處理不同時間對油松枯梢病病原菌孢子萌發(fā)的影響

2.3 內(nèi)生拮抗菌的分類鑒定

2.3.1 菌體形態(tài)特征及生理生化指標(biāo) 拮抗菌株AM-5 在LB 培養(yǎng)基上菌落為乳白色，表面干燥有褶狀隆起，與培養(yǎng)基結(jié)合牢固，質(zhì)地致密不透明；革蘭氏反應(yīng)為陽性；菌體桿狀，大小為(2.3～2.5)μm×(0.7～0.8)μm，周生鞭毛，產(chǎn)芽孢，無莢膜；可在6.5%NaCl 生長；V-P 反應(yīng)呈陽性。菌株符合芽孢桿菌的生理生化特性(表3)。

表3 菌株AM-5 的生理生化特征

2.3.2 16S rDNA 序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹 以AM-5菌株基因組為模板，經(jīng)16S rDNA 特異性引物PCR 擴增后得到一條大小約為1 500 bp 的序列。序列全長為1 474 bp，在NCBI 上與己知序列比對結(jié)果顯示菌株AM-5 與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis(GenBank 登錄號:CP032855.1)的序列相似性為100%。采用鄰接法(NJ 法)構(gòu)建菌株 AM-5 16S rDNA 序列系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。

結(jié)合該菌株的培養(yǎng)特征、形態(tài)和生理生化特征及16S rDNA 序列分析結(jié)果，將菌株AM-5 鑒定為枯草芽孢桿菌B.subtilis。

圖2 基于16S rDNA 序列構(gòu)建的菌株AM-5 系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 拮抗菌對油松枯梢病的盆栽預(yù)防和防治效果

2.4.1 預(yù)防作用 接種油松枯梢病菌7 d 后，對照組(無菌水+病原菌)開始發(fā)病，10 d 后癥狀明顯，發(fā)病松針枯黃，14 d 時發(fā)病率達(dá)75.63%。處理組(拮抗菌+病原菌)的松針發(fā)病較緩，少數(shù)松針有發(fā)病跡象，14 d 時發(fā)病率為27.03%。菌株AM-5 對油松枯梢病的預(yù)防效果為64.26%(表4)。單施拮抗菌組松針生長正常，沒有明顯變化，說明拮抗菌對松針生長幾乎無影響。

2.4.2 防治試驗 處理組和對照組健康松針經(jīng)施用病原菌7 d 后開始發(fā)病，此時處理組發(fā)病率為28.33%，對照組發(fā)病率為28.60% 。處理組(病原菌+拮抗菌)再經(jīng)拮抗菌處理7 d 后，發(fā)病情況進(jìn)展較慢，發(fā)病率為48.73%；對照組(病原菌+無菌水)再經(jīng)無菌水處理7 d 后，松針發(fā)病進(jìn)展迅速，發(fā)病率達(dá)72.36%。菌株AM-5 對油松枯梢病的防效為53.38%(表5)。

表4 拮抗菌AM-5 對油松枯梢病的預(yù)防效果

表5 拮抗菌AM-5 對油松枯梢病的防治效果

3 結(jié)論與討論

從健康油松植物組織中分離出內(nèi)生細(xì)菌40 株，以油松枯梢病病原菌為指示菌，獲得1 株拮抗作用較強的菌株AM-5?；谛螒B(tài)特征、理化特性和分子生物學(xué)等方法鑒定該菌為枯草芽孢桿菌B.subtilis。盆栽試驗表明，該菌株對油松枯梢病有良好的預(yù)防和防治作用，其預(yù)防效果和防治效果分別為64.26%和53.38%。

目前已有大量關(guān)于芽孢桿菌的報道，相關(guān)研究表明，植物內(nèi)生芽孢桿菌具有在植物內(nèi)部穩(wěn)定生存并繁殖的能力，易于在植物內(nèi)形成較大的群體，對植物病害有顯著的拮抗性。何紅 等在辣椒中分離到的枯草芽孢桿菌BS-2，對辣椒炭疽病有較強的防病效果[23]；謝學(xué)文篩選得到的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌WF-3 對黃瓜炭疽病菌顯示出了很好的抑制活性[24]；陳奕鵬在木薯中分離到類芽孢桿菌屬菌株對木薯細(xì)菌性萎蔫病有較強的抑制性，并在田間防控上有明顯的效果[25]。本研究中分離獲得枯草芽孢桿菌AM-5，對油松枯梢病菌有明顯的抑制性，盆栽防治試驗中也有較顯著的效果，可為油松枯梢病的生物防治提供生防資源和理論依據(jù)，但該菌株的田間防治效果以及定殖能力、抑菌機制等還有待進(jìn)一步研究。從現(xiàn)有研究結(jié)果來看，相對于AM-5菌體，其發(fā)酵液的抑菌作用較弱，說明其抑菌的主要成分在菌體中，但也不排除與發(fā)酵液濃度、發(fā)酵時間等有關(guān)，因此可進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件、探索發(fā)酵液的抑菌作用，以便為田間應(yīng)用提供更多、更方便的菌劑劑型。