袁曉芳 王宋平

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院呼吸一科，四川省瀘州市 646000,電子郵箱：840786087@qq.com)

哮喘是由包括嗜酸粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、平滑肌細胞、氣道上皮細胞等多種細胞及細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，病程的延長可導致一系列氣道結構的改變，即氣道重塑[1]。氣道炎癥和氣道重塑是哮喘的兩個重要特征。氣道重塑主要包括氣道管壁增厚、氣道上皮下纖維化、平滑肌細胞增生肥大、肌成纖維細胞增生以及腺上皮化生，其中以基底膜下Ⅰ型、Ⅲ型、V型膠原纖維和纖維連接素等細胞外基質(extracellular matrix，ECM)沉積增加，肌成纖維細胞活化及增殖為突出表現(xiàn)。哮喘患者體內(nèi)轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)水平呈升高趨勢,在肺組織中許多細胞，如氣道上皮細胞、白細胞、嗜酸性粒細胞及T細胞等，均能產(chǎn)生TGF-β1,而TGF-β1在氣道上皮下纖維化及氣道平滑肌重塑中起著重要作用[2-4]?；|金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)和特異性內(nèi)源性抑制因子之間的平衡在氣道壁基質沉積和結構重塑中發(fā)揮重要的作用，其可通過誘導細胞增殖分化，促進新生血管形成，刺激成纖維細胞的增生并合成膠原等多種機制引起氣道重塑[5]。

大黃素是中藥大黃的重要單體,具有抑菌、抗炎、保護肝腎、抑制血小板聚集、改善微循環(huán)、抗癌等作用，具有較好的臨床應用價值。近年來，研究顯示大黃素有降低TGF-β1及MMP-9的表達，以及減少膠原沉積的作用[6-8]。然而大黃素是否能通過影響支氣管肺組織中TGF-β1、MMP-9的表達，以及氣道膠原的沉積，從而抑制哮喘氣道重塑,目前國內(nèi)外尚缺乏相關研究。本研究通過建立哮喘小鼠氣道重塑模型，觀察大黃素對哮喘氣道重塑的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選取清潔級雌性BALB/c小鼠32只(重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司，動物許可證號：21100230045566)，6～8周齡，體重(20±2)g。將小鼠標號，采用抽簽法隨機分為正常組(A組)、哮喘組(B組)、哮喘+小劑量大黃素組(C組)、哮喘+大劑量大黃素組(D組)，每組8只。

1.2 主要試劑及儀器 卵清蛋白(Sigma公司，批號：A8040)，大黃素(北京索萊寶科技有限公司，批號：E8390)，氫氧化鋁(上海源葉科技有限公司，批號：S30353)，兔抗鼠Ⅰ型、Ⅲ型膠原一抗(Abcam公司，批號：ab90395)，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔Ⅰ型、Ⅲ型膠原二抗(Aspen有限公司，批號：ab7778)，MMP-9酶聯(lián)免疫吸附劑測定試劑盒(優(yōu)爾生公司，批號：SEA553Ra)，TGF-β1 引物(武漢金開瑞生物工程有限公司)，熒光定量PCR儀(Life Technologies公司，型號：StepOne)，酶標儀(DiaTek公司，型號：DR-200BS)，病理切片機(武漢恒意賽生物科技有限公司，型號：RM2016)，光學顯微鏡(Olympus公司，型號：CX31)，恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設備有限公司，型號：GNP9160)。

1.3 哮喘氣道重塑模型制備及給藥方式 參照文獻[9]方法制造哮喘氣道重塑模型。B、C、D組小鼠自實驗室適應性喂養(yǎng)1周開始，第0、7、14天腹腔注射卵清蛋白致敏液200 μL(含100 μg卵清蛋白+2 mg氫氧化鋁)，第21天以卵清蛋白激發(fā)液(含50 μg卵清蛋白)滴鼻建立支氣管哮喘氣道重塑模型，50 μL/次，3次/周，連續(xù)6周。C、D組自第21天起分別給予40 mg/(kg·d)、80 mg/(kg·d)大黃素[10]灌胃，A、B組以等量生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥6周。滴鼻與灌胃時間間隔無特殊要求。

1.4 肺組織標本收集 于末次激發(fā)后24 h內(nèi)斷頸處死各組小鼠，將小鼠固定于手術板上，暴露胸腔，無菌條件下迅速取出左肺組織放于-80℃冰箱保存，備用于TGF-β1及MMP-9的檢測。無菌條件下取出右肺組織用4%多聚甲醛固定，備用于蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色、Masson染色、免疫組織化學檢測。

1.5 觀察指標

1.5.1 支氣管肺組織病理學改變：將部分支氣管肺組織脫水、包埋及切片，經(jīng)蘇木素染細胞核、伊紅染細胞質及脫水封片后，在200倍光學顯微鏡下觀察支氣管肺組織病理學改變情況，觀察內(nèi)容包括支氣管壁厚度、氣道上皮損傷程度、炎癥細胞浸潤程度。

1.5.2 氣道重塑指標：將部分支氣管肺組織脫水、包埋及切片，再將石蠟切片脫蠟至水，將肺組織經(jīng)Masson染色后，在200倍光學顯微鏡下，每個標本隨機選取3個直徑在100～200 μm的完整支氣管橫截面，取其均值，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測量支氣管基底膜周徑、支氣管總面積、支氣管管腔面積、平滑肌外緣內(nèi)氣管面積、平滑肌內(nèi)緣內(nèi)氣管面積，同時用支氣管基底膜周徑將測量值標準化，標準化平滑肌厚度=(平滑肌外緣內(nèi)氣管面積-平滑肌內(nèi)緣內(nèi)氣管面積)/支氣管基底膜周徑，標準化支氣管壁厚度=(支氣管總面積-支氣管管腔面積)/支氣管基底膜周徑。同時在200倍鏡下同一樣本隨機選取3個視野，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測量膠原面積、整個圖像總面積，計算膠原面積比，膠原面積比=(膠原面積/整個圖像總面積)×100%。

1.5.3 肺組織Ⅰ型、Ⅲ型膠原含量：取出右中葉肺組織后，脫水、包埋，將石蠟切片常規(guī)脫蠟后經(jīng)乙二胺四乙酸緩沖液微波修復，經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液清洗(5 min/次，共3次)后放入3%過氧化氫溶液中，室溫下避光孵育，經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液清洗(5 min/次，共3次)后再用5%牛血清白蛋白封閉。去除牛血清白蛋白后，分別加入1 ∶150兔抗鼠Ⅰ型膠原一抗及1 ∶100的兔抗鼠Ⅲ型膠原一抗覆蓋組織，4℃過夜，經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液清洗(5 min/次，共3次)，再分別加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔Ⅰ型二抗及山羊抗兔Ⅲ型膠原二抗，37℃孵育50 min，去除磷酸緩沖鹽溶液后加入二氨基聯(lián)苯胺溶液，顯色并洗凈后用蘇木素復染，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明后，中性樹膠封固。用已知陽性切片作為陽性對照，用磷酸緩沖鹽溶液代替一抗作為陰性對照。用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測定各組Ⅰ型、Ⅲ型膠原含量，以積分光密度值表示。

1.5.4 肺組織TGF-β1 mRNA的表達：用無菌方法取約100 g肺組織，置于1 mL預冷的總RNA抽提試劑中充分研磨，加入三氯甲烷4℃ 10 000 g離心10 min，加入異丙醇再次于4℃ 10 000 g離心10 min，最后加入75%乙醇再次于4℃ 10 000 g離心10 min，待酒精完全揮發(fā)后提取肺組織RNA，在反轉錄酶作用下合成cDNA。小鼠TGF-β1上游引物為5′-GTGGCTGAACCAAGGAGACG-3′，下游引物為5′-AGGTGTTGAGCCCTTTCCAG-3′，擴增長度為195 bp；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)上游引物為 5′-CGCTAACATCAAATGGGGTG-3′，下游引物為5′-TTGCTGACAATCTTGAGGGAG-3′，擴增長度為201 bp。PCR反應體系包括2×實時熒光定量PCR反應混合物5 μL，引物工作液1 μL，模板液1 μL，蒸餾水2.8 μL，ROX參比液0.2 μL。PCR反應為95℃下預變性1 min，然后95℃變性15 s，退火溫度為58℃，20 s，72℃延伸45 s，共40個循環(huán)。其溶解曲線為60℃→95℃，每20 s升溫1℃。PCR結束后，采用2-△△Ct法計算目的基因相對表達量。

1.5.5 肺組織MMP-9含量：按照酶聯(lián)免疫吸附實驗試劑盒說明書操作，檢測小鼠肺組織MMP-9含量。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠一般情況 建立支氣管哮喘氣道重塑模型后，A組小鼠活潑好動，毛發(fā)光滑，呼吸平穩(wěn)；B組小鼠煩躁不安，頻繁打噴嚏，呼吸急促伴口唇發(fā)紺，部分小鼠出現(xiàn)小便失禁；C、D組小鼠均有打噴嚏、呼吸急促等狀況，但程度較B組小鼠輕。

2.2 各組小鼠支氣管肺組織病理學改變 A組小鼠支氣管管腔完整，內(nèi)壁光滑，上皮未見明顯損害，管腔未見上皮細胞脫落，支氣管內(nèi)未見炎癥細胞浸潤；B組小鼠支氣管管壁明顯增厚，黏膜上皮增生明顯，支氣管平滑肌層增厚，腔內(nèi)可見黏液滲出，支氣管內(nèi)炎癥細胞浸潤明顯；C組小鼠支氣管管腔內(nèi)可見脫落上皮及少許滲出，管腔可見少量炎癥細胞浸潤；D組小鼠支氣管管腔可見少許脫落上皮及滲出，管腔炎癥細胞浸潤明顯減少。見圖1。

圖1 各組小鼠支氣管肺組織病理學改變(HE染色，×200)

2.3 各組標準化支氣管壁厚度及平滑肌厚度、膠原面積比比較 B、C、D組標準化支氣管壁厚度及平滑肌厚度、膠原面積比均厚于或大于A組，B組、C組、D組上述指標依次降低(均P<0.05)。見表1。

表1 各組標準化支氣管壁厚度及平滑肌厚度、膠原面積比比較(x±s)

注：▲實驗中死亡2只。與A組比較，△P<0.05；與B組比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05。

2.4 各組肺組織Ⅰ、Ⅲ型膠原含量的比較 Ⅰ、Ⅲ型膠原在4組肺組織中均有表達。B、C、D組Ⅰ、Ⅲ型膠原水平均較A組升高，B、C、D組上述指標依次降低(均P<0.05)。見表2。

表2 各組Ⅰ、Ⅲ型膠原含量的比較(x±s)

注：▲實驗中死亡2只。與A組比較，△P<0.05；與B組比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05。

2.5 各組肺組織TGF-β1 mRNA表達水平及MMP-9含量的比較 B、C、D組TGF-β1 mRNA相對表達水平、MMP-9含量均高于A組，B、C、D組上述指標依次降低(均P<0.05)。見表3。

表3 各組肺組織TGF-β1 mRNA表達水平及MMP-9含量的比較(x±s)

注：▲實驗中死亡2只。與A組比較，△P<0.05；與B組比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05。

3 討 論

哮喘是常見的慢性呼吸道疾病之一，其患病率在全球范圍內(nèi)有逐年增加的趨勢[11]。氣道重塑是哮喘的重要特征，它包括杯狀細胞增生、上皮下膠原沉積、平滑肌增生肥大等。氣道重塑程度與哮喘的嚴重程度密切相關，且氣道重塑在哮喘的早期即已出現(xiàn)，并隨疾病進程呈進行政性加重；即使哮喘癥狀獲得短暫緩解，氣道重塑仍呈進行性加重，并伴有肺功能的下降，可發(fā)展為不可逆的氣道阻塞[12]。本研究結果顯示，經(jīng)卵清蛋白致敏的B、C、D組哮喘小鼠標準化支氣管壁厚度及平滑肌厚度、氣道基底膜下膠原面積均增加(P<0.05)，提示3組小鼠均存在氣道重塑。

TGF-β具有調節(jié)細胞生長和分化的作用，是由巨噬細胞、上皮細胞、成纖維細胞、嗜酸性粒細胞產(chǎn)生的促纖維化細胞因子，與哮喘的發(fā)生、發(fā)展密切相關[13]。許多學者認為TGF-β1在過敏性氣道炎癥及氣道重塑中起著重要的主導作用，其不僅可以通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、P38、細胞外調節(jié)蛋白激酶、C-jun氨基末端激酶等通路的激活，誘導氣道平滑肌細胞的增殖和肥大，還可以通過誘導哮喘氣道上皮細胞上皮-間質轉化，導致成纖維細胞數(shù)量增加，并引起ECM的蛋白合成和分泌，從而參與氣道重塑[4，14]。本研究結果顯示，B、C、D組TGF-β1 mRNA相對表達水平高于A組(P<0.05)，與國內(nèi)外研究結果相符，進一步說明TGF-β1參與氣道重塑。

MMP是由20多種高度保守的鋅、鈣離子依賴性蛋白內(nèi)切酶所組成的蛋白，可降解ECM。MMP及其組織抑制劑之間的平衡在合成及降解氣道ECM中發(fā)揮重要作用。MMP-9作為MMP主要的存在形式，與哮喘有著密切聯(lián)系。研究表明，哮喘狀態(tài)下肺組織中MMP-9表達明顯升高，這可引起上皮成纖維細胞增殖、活化，以及大量膠原纖維增生，從而促進氣道重塑[15]。MMP-9不僅能引起膠原蛋白Ⅲ、膠原蛋白Ⅴ和肌腱蛋白沉積，還可降解ECM中的大部分成分如Ⅳ型膠原，并且通過釋放固定化生長因子來促進平滑肌增生，而增生的平滑肌細胞進一步釋放MMP-9，從而加重氣道重塑。除此之外，MMP-9還可以促使平滑肌細胞移行到血管基質，擴大血管的表面積，使血管壁變薄，促進新血管形成,從而參與氣道重塑中的血管重構[16]。本研究結果顯示，B、C、D組MMP-9含量高于A組(P<0.05)，提示MMP-9可能與氣道重塑密切關系。

大黃素為中藥大黃、百合等的活性成分，是單蒽核類1,6,8-三羥基蒽醌衍生物。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)大黃素不僅能降低哮喘氣道炎癥，其對肺纖維化及慢性胰腺纖維化也有緩解作用[6，17]。本研究結果顯示,B、C、D組標準化支氣管壁厚度及平滑肌厚度、氣道基底膜下膠原面積比、TGF-β1 mRNA相對表達水平依次減小或降低(均P<0.05)，提示大黃素可能是通過降低TGF-β1 mRNA表達從而改善哮喘小鼠氣道重塑，且大劑量的大黃素對氣道重塑的抑制作用更明顯。國內(nèi)外研究也證實大黃素極可能通過Smad 2/3/7通路負性調節(jié)TGF-β1的表達而改善氣道重塑[18-19]。本研究結果還顯示，B、C、D組肺組織中MMP-9及Ⅰ、Ⅲ型膠原含量依次降低(均P<0.05)，提示大黃素還可能通過降低MMP-9及Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量，從而減輕氣道重塑，且大劑量的大黃素的作用更明顯。其可能是通過抑制MAPK激酶的激酶-MAPK激酶-MAPK信號通路，降低核轉錄因子-κB活化，以及抑制p38-MAPK和Janus激酶-信號傳導子與轉錄激活子信號通路的激活，從而改善氣道重塑[19-22]。

綜上所述，大黃素可改善哮喘小鼠氣道重塑，且大劑量的抑制作用更明顯；其機制可能與大黃素抑制TGF-β1 mRNA、MMP-9、氣道壁Ⅰ型及Ⅲ型膠原的表達有關。