胡勇， 劉芳*

(貴州醫(yī)科大學(xué) 神經(jīng)病學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

阿爾茲海默癥 (alzheimer’s disease，AD)俗稱老年癡呆癥，是一種病程緩慢的認(rèn)知障礙性疾病，以腦內(nèi)β-樣淀粉蛋白沉積、神經(jīng)原纖維纏結(jié)為主要的病理生理學(xué)改變?yōu)樘卣鱗1]。研究表明，在中國(guó)>65歲的人群中，癡呆的患病率約4.98%～5.9%，隨著年齡的增長(zhǎng)，癡呆和AD在中國(guó)的患病率顯著上升[2]。AD分為主觀認(rèn)知減退(subjective cognitive decline，SCD)、輕度認(rèn)知障礙期 (mild cognitive impairment，MCI)及癡呆期 (dementiaof Alzheimer’s type，DAT)3個(gè)階段[2-3]。Jessen等[4]提出，主觀認(rèn)知減退是指?jìng)€(gè)體自感存在記憶或者其他認(rèn)知功能較前出現(xiàn)下降．但無(wú)客觀神經(jīng)心理檢測(cè)缺損的證據(jù)。近年來SCD的相關(guān)研究成為認(rèn)知障礙研究的熱點(diǎn)，腦脊液、結(jié)構(gòu)或功能磁共振、甚至FDG-PET和PIB-PET均有報(bào)告證實(shí)SCD階段 確實(shí)存在AD相關(guān)病理改變[5]。多項(xiàng)研究證實(shí)載脂蛋白E基因(Apo lipoprotein E gene，ApoE)與AD及MCI 階段密切相關(guān)[6-7]，ApoEε4等位基因是阿爾茲海默癥發(fā)病的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本文探討SCD患者與正常老年人的Apo E基因多態(tài)性，分析其與SCD的相關(guān)性,旨在為SCD的防治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 對(duì)象與入組標(biāo)準(zhǔn)

從2016年9月～2017年9月神經(jīng)內(nèi)科住院及門診就診患者中選取≥60歲SCD患者130例為SCD組，另選取同期體檢的健康人120例健康者為對(duì)照組；SCD組中男75例、女55例，60～83歲、平均(72.8±8.1)歲；對(duì)照組中男68例、女52例，61～85歲，平均(73.1±8.6)歲。兩組被檢者年齡、性別等資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SCD入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)記憶減退主訴的評(píng)定采用Lam等[8]開發(fā)的中國(guó)記憶癥狀量表 (chinese memory symptoms scale，CMSS)，該量表包括“您是否經(jīng)常遺忘物品的擺放位置”、“無(wú)法想起好朋友的姓名”、“對(duì)談話的內(nèi)容無(wú)法想起”、“有主觀記憶問題”及“明顯感覺自己的記憶力比同齡其他老人差”5個(gè)條目，如果2個(gè)以上條目均回答有，則認(rèn)為有主觀記憶減退；(2)認(rèn)知功能的評(píng)定采用簡(jiǎn)易智力狀態(tài)檢查量表及北京版蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表，兩量表均采用按文化程度校正的臨界分值標(biāo)準(zhǔn)，即MMSE得分中學(xué)或以上(受教育年限>6年)者≤24分則視為存在認(rèn)知功能障礙、27～30分為正常，MoCA得分中學(xué)或以上(受教育年限>6年)者≤24分視為有認(rèn)知功能障礙、≥26分認(rèn)知正常(本研究以受教育程度為中學(xué)以上為對(duì)象進(jìn)行對(duì)照研究，故以MMSE≥27分，MoCA≥26分排除認(rèn)知功能障礙)；(3)日常生活能力量表(ADL)<26分，排除日常生活受損；(4)焦慮自評(píng)量表(SAS)<50分，抑郁自評(píng)量表(SDS)<53分，排除焦慮抑郁情緒對(duì)認(rèn)知的影響；(5)符合納入標(biāo)準(zhǔn)。正常對(duì)照組入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)無(wú)記憶減退主訴，(2)MMSE≥27分、MoCA≥26分。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本采集 對(duì)兩組被檢者，均抽取晨起7時(shí)空腹外周靜脈血2 mL，采用3.8%檸檬酸鈉抗凝，將白細(xì)胞基因組DNA通過鹽析法提取，放置于-20 ℃的冰箱中儲(chǔ)藏。

1.2.2ApoE 基因多態(tài)性檢測(cè) 將提取出來的基因進(jìn)行擴(kuò)增，使用Primer Premier5軟件設(shè)計(jì)及并合成ApoE基因的引物，上游引物序列為5′-AGGAACAACTGACCCCGGT-3′，下游引物為5′-TGCTCCTTCACCTCGTCCA-3′。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)體系50 μL，Prem Taq(Ex Tag Version)2.0D331A 12.5 μL，基因組 DNA0.3 μg，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，加滅菌蒸餾水定容至50 μL。PCR反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)后，72 ℃繼續(xù)延伸6 min后降至4 ℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司SK1141) 純化后，對(duì)靶基因進(jìn)行直接測(cè)序，采用的儀器是3730序列分析儀，得到不同ApoE基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg 吻合度檢驗(yàn)

兩組的ApoE基因型頻率及等位基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，具有較好的吻合度 (χ2=4.78、2.35，P>0.05) 。見表1。

表1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)Tab.1 Hardy-Weinberg genetic balance test

2.2 ApoE 基因型分布

分析兩組被檢者ApoE基因型多態(tài)性，最常見的基因型是ε3/ε3，SCD組為64.61%、對(duì)照組為67.86%，SCD組ε3/4(18.46%)及ε4 /4(6.15%)基因型頻率高于對(duì)照組(14.17%、0.90%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.139、4.173，P<0.05)。見表2。

表2 SCD組與對(duì)照組被檢者ApoE基因型頻率分布Tab.2 Frequency distribution of ApoE genotypes in SCD group and control group

2.3 ApoE 等位基因頻率

比較兩組被檢者ApoE等位基因分布頻率可見，SCD組和對(duì)照組ε4等位基因頻率分別為17.69%、7.91%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.421，P=0.036)，兩組被檢者ApoE等位基因頻率均以ε3最高(SCD組為75%，對(duì)照組為81.67%)，見表3。

表3 SCD組與對(duì)照組被檢者ApoE等位基因頻率Tab.3 Frequency distribution of ApoE allele in SCD group and control groups

2.4 ApoE 等位基因頻率風(fēng)險(xiǎn)

通過計(jì)算OR值估計(jì)ApoE基因與SCD的關(guān)系，結(jié)果證明ApoEε2、ε3 等位基因與SCD發(fā)病無(wú)顯著相關(guān)性。ApoEε4等位基因與SCD呈正相關(guān)性，見表4。對(duì)于年齡、性別混雜因素影響，在統(tǒng)計(jì)分析中進(jìn)行了Logistic回歸校正，最大限度地控制了混雜因素影響。見表5。

表4 ApoE 等位基因頻率與SCD風(fēng)險(xiǎn)分析Tab.4 The risk analysis of the relationship between ApoE allele frequency and SCD

3 討論

認(rèn)知功能損傷是AD的主要表現(xiàn)，其病因及具體的發(fā)病機(jī)制未明，在進(jìn)行早期診斷時(shí)容易誤診和漏診，臨床治療上存在較大的困難和差異。最近的一項(xiàng)縱向研究表明SCD是未來認(rèn)知功能障礙和認(rèn)知障礙發(fā)展的預(yù)測(cè)因子[9]。臨床中，在老年人MMSE及Moca等相關(guān)認(rèn)知量表評(píng)測(cè)上還沒有表現(xiàn)出明顯認(rèn)知下降時(shí)，就針對(duì)患者的病情做出有效的護(hù)理和防治對(duì)延緩患者的病情蔓延和發(fā)展具有十分重要的意義，對(duì)早期預(yù)防阿爾茲海默癥及治療具有重大意義[10]。

多項(xiàng)臨床隨訪研究均證實(shí)SCD與AD的轉(zhuǎn)歸相關(guān)。Meta分析研究比較了28項(xiàng)SCD相關(guān)隨訪結(jié)果后發(fā)現(xiàn)SCD較對(duì)照組發(fā)展為癡呆的風(fēng)險(xiǎn)約2倍[11]。SCD發(fā)展為癡呆和MCI的年轉(zhuǎn)化率分別為2.3%和6.6%[12]。國(guó)外對(duì) SCD 的研究已進(jìn)入到概念的提出、評(píng)估方法的制定、SCD 行為的改變[13]，甚至是干預(yù)方法的探索[14]等方面。目前國(guó)內(nèi)進(jìn)行ApoE的多態(tài)性與MCI及AD相關(guān)性的研究較多，而比較與SCD相關(guān)性文章較少，這也是開展本項(xiàng)研究的意義所在。ApoE基因位點(diǎn)具有多態(tài)性這一結(jié)論是1975年一名外國(guó)的學(xué)者在進(jìn)行電聚焦實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)的。目前比較統(tǒng)一的說法是由于年齡、種族和區(qū)域的不同，ApoE等位基因的分布頻率也不同。ApoE的3種等位基因在自然人群的分布頻率為ε3占大多數(shù)，為70%～80%，ε2和ε4分別占5%～10%和10%～15%[15]。目前認(rèn)為機(jī)體血清中的Ch和脂質(zhì)的代謝受到ApoE基因的影響從而產(chǎn)生各種疾病。

為了進(jìn)一步探討ApoE與SCD發(fā)病率之間的關(guān)系，本研究重點(diǎn)比較SCD患者與正常老年人的ApoE基因多態(tài)性。曾有相關(guān)研究對(duì)患者與健康受試者的ApoE基因數(shù)據(jù)進(jìn)行回顧性分析，結(jié)果表明，SCD患者的ε4 基因頻率明顯增高，提示其可能與SCD患病存在相關(guān)性[16]。在本研究發(fā)現(xiàn)兩組Apo E基因型多態(tài)性相比，SCD組被檢者ε3/4(18.46%)及ε4/4(6.15%)基因型頻率高于對(duì)照組(14.17%，0.90%)(χ2=4.139,4.173，P<0.05)，ε3/ε3是最常見的基因型(SCD組為64.61%，對(duì)照組為67.86%)。在等位基因多態(tài)性分布頻率比較中，結(jié)果顯示SCD組和對(duì)照組被檢者ε4 等位基因頻率分別為 17.69%、7.91%，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義(χ2=4.421，P=0.036),ε3是最常見的等位基因，其中SCD組被檢者為64.61%，對(duì)照組為67.86%。這一結(jié)果支持ApoEε4基因與SCD患病存在可能聯(lián)系。

本研究通過風(fēng)險(xiǎn)分析提示ApoEε4等位基因與SCD呈正相關(guān)性(OR=1.922)，混雜基因校正后OR=2.011。攜帶 Apo Eε4 等位基因者患SCD的可能性是未攜帶者的2.24倍，推測(cè)ApoEε4等位基因可能是SCD患病的風(fēng)險(xiǎn)因子之一。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)SCD的患病率與ε4 基因的個(gè)數(shù)呈正相關(guān)，家族性的SCD患者中隨著ε4基因的個(gè)數(shù)增加，SCD的患病率甚至可增至90%[17]，這與本研究結(jié)果相似。

綜上所述，ApoEε4基因是SCD患病的重要危險(xiǎn)因素，ε4基因個(gè)數(shù)的增加會(huì)提高SCD的患病率。通過檢測(cè)ApoE等位基因，早期識(shí)別SCD，從SCD階段進(jìn)行干預(yù)，國(guó)外一些相關(guān)研究表明，某些藥物及非藥物治療可能會(huì)有一定的作用，如神經(jīng)節(jié)苷脂臨床試驗(yàn)、對(duì)SCD患者進(jìn)行冥想訓(xùn)練及正念訓(xùn)練(mindfulness training)，可能對(duì)SCD向MCI甚至AD轉(zhuǎn)化有一定的延緩作用[18-20]。