王宏健， 劉曉紅， 董宇華， 郭陽(yáng)， 王旭東

(貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

calpain 2乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，其中約70%為雌激素(Estrogen, E2)依賴性[1]。E2不僅在女性生殖系統(tǒng)和乳腺生長(zhǎng)發(fā)育等生理功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，在異常情況下，E2也是促進(jìn)乳腺癌惡性進(jìn)展的重要因素[2-4]。E2可以使乳腺癌細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)增多，從而激活蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)，激活的cAMP/ PKA途徑可抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移[5-8]。有研究顯示，纖連蛋白(fibronectin, FN)的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的惡性行為[9]，其機(jī)制尚未完全闡明。鈣激活中性蛋白酶(calcium-activated neutral protease，CANP)屬于Ca2+依賴性的半胱氨酸蛋白酶水解家族，據(jù)報(bào)道其活性在乳腺癌異常增高[10]。然而，關(guān)于PKA是否通過(guò)CANP參與調(diào)控E2信號(hào)分子機(jī)制，目前尚未完全闡明。本研究以MCF-7細(xì)胞和CANP2-shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞為模型細(xì)胞，采用傷口愈合實(shí)驗(yàn)和蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)等方法，觀察PKA抑制劑對(duì)E2誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的遷移和FN蛋白表達(dá)的影響，同時(shí)觀察其與CANP的關(guān)系，為研究E2促進(jìn)乳腺癌惡性進(jìn)展的機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞系及試劑 人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)，DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶及青霉素/鏈霉素均購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS) 購(gòu)自Gibco公司。

1.1.2抗體及重要試劑17β-雌二醇(17β-estradiol，E2) 購(gòu)于Sigma公司、H89(PKA抑制劑)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司，抗FN、calpain2單克隆抗體，抗GAPDH抗體由Santa cruz公司購(gòu)買，羊抗小鼠IgG-HRP抗體購(gòu)自武漢博士德公司，CANP2-shRNA設(shè)計(jì)、合成和構(gòu)建由上海吉瑪制藥有限公司提供。

1.2 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞MCF-7采用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10% FBS、1%青霉素及1%鏈霉素)，在37 ℃及5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞滿度達(dá)90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞混懸液按每孔1 mL接種于12孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞覆蓋率達(dá)90%后，換成無(wú)血清DMEM，用10 μL槍頭作“|”字劃痕，用無(wú)菌PBS洗滌3次，換無(wú)血清的DMEM，隨機(jī)分為4組，分別加入0.1% DMSO(對(duì)照組)、10 nmol/L(E2組)、10 mg/L(H89組)、10 nmol/L E2+10 mg/L H89(E2+H89聯(lián)合組)處理，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分別于0 、12及24 h時(shí)用倒置顯微鏡下拍照。每孔隨機(jī)取3個(gè)位點(diǎn)，用Photoshop軟件標(biāo)尺測(cè)量劃痕寬度，測(cè)算細(xì)胞劃痕部位“傷口”寬度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞遷移率=[(0 h傷口寬度-12或24 h傷口寬度)/0 h傷口寬度]×100%。

1.2.3Western blot檢測(cè)FN蛋白表達(dá) 培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞滿度達(dá)50%～60%后，將培養(yǎng)基換為無(wú)血清DMEM，同時(shí)將細(xì)胞分為對(duì)照組(0.1%DMSO)、E2組(10 nmol/L E2)、H89組(10 mg/L)及E2+ H89組(10 nmol/L E2+10mg/L H89)。藥物作用48 h后，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞。4 ℃，12 000 r/min離心20 min后取樣品上清液留用，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。每個(gè)泳道按30 μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行上樣，按照Western blot實(shí)驗(yàn)，采用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(Syngene公司)成像，GeneSnap軟件分析蛋白印跡結(jié)果。

1.3 CANP2-shRNA轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF-7細(xì)胞

1.3.1CANP2-shRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞與穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選 按照說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行CANP2-shRNA轉(zhuǎn)染并且篩選出穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，待細(xì)胞達(dá)到檢測(cè)所需滿度時(shí)，使用熒光顯微鏡觀察并且通過(guò)Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株后繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱中37 ℃溫育24～48 h后，用嘌呤霉素處理篩選出穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。同時(shí)轉(zhuǎn)染與CANP2無(wú)同源性的序列作為陰性對(duì)照組(NC組)。

1.3.2細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CANP2-shRNA穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的MCF-7細(xì)胞株和NC(negative control)細(xì)胞按每孔1 mL接種于12孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞覆蓋率達(dá)90%后，換成無(wú)血清DMEM，用10 μL槍頭作“|”字劃痕，用無(wú)菌PBS洗滌3次，換無(wú)血清的DMEM，均隨機(jī)分為4組，分別為對(duì)照組、E2組、H89組及E2與H89聯(lián)合組，其余處理同1.2.2。

1.3.3Western blot檢測(cè)FN蛋白表達(dá) 培養(yǎng)的CANP2-shRNA穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞和NC細(xì)胞覆蓋率達(dá)50%～60%后，將培養(yǎng)基換為無(wú)血清DMEM，同時(shí)將細(xì)胞分為對(duì)照組(0.1% DMSO)、E2組(10 nmol/L E2)、H89組(10 mg/L)及E2+ H89組(10 nmol/L E2+10 mg/L H89)，其余處理同1.2.3。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用軟件prism 6.2處理和分析數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用單因素方法one-way ANOVA進(jìn)行分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H89對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的作用

2.1.1H89增強(qiáng)E2誘導(dǎo)的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞遷移效應(yīng) 與對(duì)照組比較，E2可明顯增加MCF-7細(xì)胞的12 h和24 h時(shí)的遷移率,分別增加(14.30±0.62)%和(28.74±3.89)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。H89組MCF-7細(xì)胞24 h時(shí)，可促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的遷移，與對(duì)照組比較，遷移率增加了(20.41±1.46)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。H89與E2組MCF-7細(xì)胞作用24 h后，細(xì)胞的遷移率增加了(31.71±2.13)% 。與E2組比較，H89與E2聯(lián)合作用后，MCF-7細(xì)胞的12 h和24 h的遷移率均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.1.2H89增加E2誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞FN蛋白表達(dá) 與對(duì)照組比較，E2組FN蛋白表達(dá)增加(121.9±9.342)%；H89 FN蛋白的表達(dá)增加(115.4±8.89)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與E2組比較，H89+E2組MCF-7細(xì)胞FN蛋白表達(dá)增加(105.9±15.9)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖2。

(1)與對(duì)照組比較, P<0.05 ；(2)與E2組比較, P<0.05圖1 H89對(duì)E2誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞遷移的影響Fig.1 Effect of H89 on E2-induced migration of MCF-7 cells

(1)與對(duì)照組比較, P<0.01;(2)與E2組比較,P<0.01圖2 H89對(duì)MCF-7細(xì)胞纖連蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of H89 treatment on the expression of FN in MCF-7

2.2 H89對(duì)CANP2-shRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞的作用

2.2.1CANP2-shRNA轉(zhuǎn)染后MCF-7細(xì)胞中CANP2蛋白表達(dá) 與NC組比較，CANP2-shRNA轉(zhuǎn)染MCF-7乳腺癌細(xì)胞組CANP2蛋白表達(dá)量降低了(88.47±7.07)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖3。結(jié)果提示沉默CANP2基因后，篩選的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株滿足實(shí)驗(yàn)要求。

(1)與對(duì)照組比較 , P<0.01圖3 CANP2-shRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞CANP2蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of CANP2 protein in CANP2-shRNA transfected cells

2.2.2CANP2-shRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞中，H89的促細(xì)胞遷移效應(yīng) H89組明顯降低CANP2-shRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞的遷移率，見(jiàn)圖4A；與NC組比較，H89組CANP2-shRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞遷移率24 h和48 h時(shí)分別降低了(66.67±9.67)%和(123.04±20.54)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖4B?；虺聊珻ANP2后，與NC組比較，E2+H89聯(lián)合組CANP2-shRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞的遷移率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖4C。E2+H89組細(xì)胞遷移率24和48 h的細(xì)胞遷移率分別降低(78.12±6.12)%和(115.35±12.09)%，見(jiàn)圖4D。

(1)與對(duì)照組比較 , P<0.01圖4 基因沉默CANP2逆轉(zhuǎn)H89的促細(xì)胞遷移的影響Fig.4 Transfection of shRNA CANP2 reversing the effect of H89 on cell migration

2.2.3H89抑制CANP2-shRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞中FN蛋白表達(dá) H89單獨(dú)作用于CANP2-shRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，與NC組比較，F(xiàn)N蛋白的表達(dá)明顯減少，相對(duì)蛋白表達(dá)量減少(60.52±4.99)% ，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；H89與E2聯(lián)合使用時(shí)，與NC組比較，CANP2-shRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞的FN蛋白表達(dá)減少(81.75±4.26)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖5。

(1)與對(duì)照組比較, P<0.01圖5 H89對(duì)CANP2-shRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞FN蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of H89 on the expression of fibronectin in cell line of CANP2 gene silencing

3 討論

近年來(lái)，乳腺癌的早期診斷和臨床治療取得了較大進(jìn)展，但絕大多數(shù)病人仍死于腫瘤的轉(zhuǎn)移。大量研究表明，作為體內(nèi)主要的性激素，E2能刺激乳腺腫瘤的生長(zhǎng)并促進(jìn)其轉(zhuǎn)移和侵襲[11]，但其具體作用機(jī)制尚未完全闡明。cAMP/PKA 通路是一條經(jīng)典的由 G 蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，參與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)節(jié)新陳代謝及基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)[12-13]。Filardo等人[14]的研究顯示，在MCF-7和SKBR3細(xì)胞中，E2可以快速激活膜結(jié)合的腺苷酸環(huán)化酶 (adenylate cyclase, AC)，進(jìn)而在數(shù)分鐘內(nèi)即引起細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度增高，并激活PKA，繼而引起細(xì)胞功能的改變。因此，闡明E2-PKA下游信號(hào)通路，有助于加深對(duì)E2促癌效應(yīng)分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)。Clarysse等[15]報(bào)道，激活cAMP-PKA 途徑能降低人乳腺癌MDA-MB-435s的細(xì)胞遷移率。Lee等[16]的研究表明，cAMP-PKA也能調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的遷移。在本研究中結(jié)果亦顯示單獨(dú)使用H89能夠增加細(xì)胞的遷移率。本研究發(fā)現(xiàn)，PKA選擇性抑制劑H89可明顯增強(qiáng)E2的促細(xì)胞遷移效應(yīng)，提示cAMP/PKA途徑對(duì)E2促細(xì)胞遷移效應(yīng)可能具有負(fù)性調(diào)控作用。國(guó)內(nèi)外均有研究顯示，腫瘤中FN表達(dá)增加和表型改變可促進(jìn)腫瘤的增殖，遷移和侵襲；而且還可以限制腫瘤細(xì)胞對(duì)治療的反應(yīng)性[17-18]。同時(shí)本課題組的前期研究顯示E2可通過(guò)上調(diào)FN來(lái)促進(jìn)MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞的遷移[19]。而本研究結(jié)果顯示H89能夠顯著增強(qiáng)E2對(duì)MCF-7細(xì)胞纖連蛋白FN表達(dá)的上調(diào)作用，表明cAMP/PKA途徑對(duì)E2的抑制效應(yīng)可能也與纖連蛋白FN表達(dá)有關(guān)。有研究顯示，cAMP/PKA可通過(guò)CANP而調(diào)控細(xì)胞遷移活動(dòng)[20]。本課題組亦曾報(bào)道，CANP抑制劑Calpeptin(Calp)能明顯抑制E2誘導(dǎo)的FN蛋白上調(diào)[19],但Calp對(duì)CANP1和CANP2均有抑制效應(yīng)，不能明確何種CANP亞型參與對(duì)FN的上調(diào)作用。

為進(jìn)一步查明E2-PKA下游是否通過(guò)CANP2分子來(lái)影響乳腺癌細(xì)胞的遷移及FN表達(dá)，本研究采用CANP2-shRNA轉(zhuǎn)染模型細(xì)胞并篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因沉默CANP2后，H89對(duì)E2促細(xì)胞遷移效應(yīng)的上調(diào)作用受到明顯抑制。同時(shí)，基因沉默CANP2后，H89對(duì)E2誘導(dǎo)的FN蛋白表達(dá)上調(diào)的作用也被逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果提示，PKA通過(guò)CANP2-FN通路對(duì)E2促癌效應(yīng)發(fā)揮重要的負(fù)性調(diào)控作用。表明E2誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞FN蛋白表達(dá)和細(xì)胞遷移與PKA-CANP2通路有關(guān)。