邸鐵濤， 張春玲**， 陳露， 侯丹， 劉洹穎， 龍麗， 黃薔

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院， 貴州 貴陽(yáng) 550001; 2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

糖尿病潰瘍(diabetic ulcers，DU)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)30% 的糖尿病患者會(huì)發(fā)生皮膚潰瘍，且潰瘍存在難以愈合等問(wèn)題。目前促進(jìn)糖尿病潰瘍愈合成為研究熱點(diǎn)，調(diào)控生長(zhǎng)因子的輔助療法在糖尿病潰瘍治療中具有顯著優(yōu)勢(shì)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，潰瘍的愈合與創(chuàng)面的表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等密切相關(guān)，這些因子的表達(dá)可促進(jìn)創(chuàng)面的愈合[2]。中藥丹黃散由大黃、丹參、當(dāng)歸、沉香、松香、沒(méi)藥共六味傳統(tǒng)中藥組成，具有清熱解毒、祛腐生肌等功效[3-5]。研究顯示，丹黃散可明顯促進(jìn)糖尿病患者潰瘍創(chuàng)面的愈合，具體有很好的臨床療效[6]，但其促愈機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立SD大鼠糖尿病潰瘍模型，使用中藥丹黃散外敷糖尿病大鼠潰瘍創(chuàng)面，觀察創(chuàng)面愈合過(guò)程中大鼠血清及局部創(chuàng)面組織中EGF、bFGF、VEGF的表達(dá)水平，探討丹黃散促進(jìn)糖尿病潰瘍愈合的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物、試劑與儀器 SPF級(jí)SD大鼠，雄性，200 g左右，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物研究所。酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，VFGF、β-actin購(gòu)自proteintech公司，bFGF、EGF購(gòu)自美國(guó)abcam公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/山羊抗小鼠IgG購(gòu)自中山金橋公司。

1.1.2藥物制備 中藥丹黃散由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科制備，大黃、丹參、當(dāng)歸、沉香、松香、沒(méi)藥六味中藥按照1∶1比例混合、粉碎、過(guò)六號(hào)篩后取細(xì)粉。對(duì)照西藥選用重組人EGF凝膠(購(gòu)自桂林華諾威基因藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)14020213)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1模型制備12只對(duì)照組大鼠正常飼料喂養(yǎng)。36只大鼠制作糖尿病大鼠模型。糖尿病大鼠模型制備采用目前較為常用糖尿病潰瘍制作方法[7]。SD大鼠采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)一個(gè)月，隔夜禁食后腹腔注射STZ 40 mg/kg，3 d后測(cè)空腹血糖大于16.7 mmol/L為造模成功。糖尿病大鼠造模成功后第5天，在所有大鼠(含正常對(duì)照組)背部較為平坦之處脫毛，龍膽紫標(biāo)記約1.5 cm×1.5 cm面積，將該區(qū)域皮膚剪去，深達(dá)筋膜。

1.2.2分組與給藥 將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC)、糖尿病潰瘍組(DM)、糖尿病潰瘍-丹黃散組(DM-中藥)、糖尿病潰瘍-EGF組(DM-西藥),每組各12只大鼠；后3組大鼠制備糖尿病潰瘍模型，造模成功24 h后，DM組大鼠創(chuàng)面僅用碘伏消毒，DM-中藥組大鼠創(chuàng)面碘伏消毒后外敷“丹黃散”,DM-西藥組大鼠創(chuàng)面碘伏消毒后外敷重組人EGF凝膠；NC組大鼠潰瘍表面用碘伏消毒；各組大鼠背部潰瘍均用6層醫(yī)用小紗布(6 cm×6 cm)覆蓋，用醫(yī)用膠布包扎固定，每天換藥1次，觀察至潰瘍創(chuàng)面完全愈合，隔日創(chuàng)面拍照并記錄最終愈合時(shí)間。丹黃散用量參照臨床成人用量，根據(jù)徐叔云[8]的計(jì)算公式，大鼠等效劑量相當(dāng)于人的9.1倍，得出大鼠丹黃散膏劑用量為2 g；重組人EGF凝膠用量也為2 g；敷藥面積均為超出創(chuàng)面邊緣0.2 cm，厚度為0.2 cm。

1.2.3潰瘍愈合率 造模后第1天、14天、28天測(cè)定大鼠潰瘍創(chuàng)面面積，采用快示格膠貼勾畫(huà)潰瘍場(chǎng)面輪廓線，置于白色背景 A4紙上，拍照，采用ImageJ計(jì)算其面積。創(chuàng)面愈合率(%)=(初始面積-當(dāng)前測(cè)量面積)/初始面積×100%[9]。

1.2.4血清bFGF、EGF及VFGF水平檢測(cè) 干預(yù)后第14、28天，大鼠內(nèi)眥取血，分離血清，按照bFGF、EGF及VFGF的酶聯(lián)免疫試劑盒說(shuō)明書(shū)操作并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，每孔加待測(cè)樣本10 μL、樣品稀釋液40 μL，加酶50 μL，37 ℃孵育30 min，洗滌5次，顯色，終止，檢測(cè)OD450值,計(jì)算大鼠血清中bFGF、EGF及VFGF的含量，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.2.5Q-PCR檢測(cè)大鼠新生肉芽組織中bFGF、EGF及VFGFmRNA的表達(dá) 干預(yù)后第14、28天取各組大鼠新生肉芽組織，提取RNA，采用Q-PCR法檢測(cè)大鼠新生肉芽組織中bFGF、EGF及VFGFmRNA的表達(dá)量。引物序列：EGF上游引物為5′-AAGATCGTAGAGCCAGGC，下游引為CCTCGATGCTCTGGT TTA-3′；bFGF上游引物為5′-TCCAGGCGTTCAAAGAAGAA-3′，下游引物為5′-CCATCAAGGGAGTGTGTGC-3′；VEGF上游引物為5′-GGCA GCTTGTAAACGAAC-3′，下游引物為5′-TGGTGACATGGTTAATCGGTC-3′。反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL、PCR Forward Primer 0.8 μL、PCR Reverse Primer 0.8 μL、ROX Reference Dye 0.4 μL、dH2O 6 μL、DNA 模板2 μL,進(jìn)行相對(duì)定量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次以上。

1.2.6Western Blot 檢測(cè)大鼠新生肉芽組織中bFGF、EGF及VFGF蛋白表達(dá) 干預(yù)后第14、28天取各組大鼠少量新生肉芽組織，提取蛋白定量后保存。配置10%的SDS-PAGE蛋白凝膠進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，隨后分別用bFGF、EGF、VFGF及β-actin的一抗室溫孵育2～3 h，用相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶4 000)室溫孵育1 h，超敏發(fā)光液顯色，Western Blot曝光儀中曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)面愈合情況

干預(yù)后第14、28天，與DM組比較，NC組、DM-中藥組及DM-西藥組大鼠背部創(chuàng)面愈合率均明顯提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；干預(yù)后第28天，DM-中藥組創(chuàng)面愈合率高于DM-西藥組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

注：A為大鼠背部創(chuàng)面，B為干預(yù)第14天，C為干預(yù)第28天，(1)與DM組比較，P<0.05；(2)與DM-西藥組比較，P<0.05圖1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)背部潰瘍創(chuàng)面愈合情況及愈合率Fig.1 The effect of Danhuang powder on wound healing and healing rate of rat back ulcers at different time points

2.2 血清中bFGF、EGF、VEGF含量

干預(yù)后第14、28天，與DM組比較，NC組、DM-中藥組、DM-西藥組大鼠血清中bFGF、EGF及VEGF含量明顯提高(P<0.05)；干預(yù)后第28天，DM-中藥組大鼠血清中bFGF、EGF及VEGF含量高于DM-西藥組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清中bFGF、EGF、VEGF水平Tab.1 The effect of Danhuang powder on the levels of serum bFGF, EGF and VEGF

(1)與DM組比較，P<0.05；(2)與DM-西藥組比較，P<0.05

2.3 背部潰瘍創(chuàng)面新生肉芽組織中bFGF、EGF、VEGF mRNA表達(dá)

干預(yù)后第14、28天，與DM組比較，NC組、DM-中藥組、DM-西藥組大鼠新生肉芽組織中bFGF、EGF及VEGFmRNA表達(dá)水平明顯提高(P<0.05)；干預(yù)后第28天，DM-中藥組大鼠新生肉芽組織中bFGF、EGF及VEGFmRNA表達(dá)水平高于DM-西藥組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

(1)與DM組比較，P<0.05；(2)與DM-西藥組比較，P<0.05圖2 各組大鼠新生肉芽組織中bFGF、EGF、VEGF mRNA表達(dá)水平Fig.2 The effect of Danhuang powder on the mRNA expression levels of bFGF, EGF and VEGF in newborn granulation tissues

2.4 背部潰瘍新生肉芽組織中bFGF、EGF及VFGF蛋白表達(dá)

干預(yù)后第14、28天，與DM組比較，NC組、DM-中藥組、DM-西藥組大鼠背部潰瘍新生肉芽組織中bFGF、EGF、VEGF 蛋白表達(dá)水平明顯提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；干預(yù)后第28天，DM-中藥組大鼠新生肉芽組織中bFGF、EGF、VEGF 蛋白表達(dá)水平高于DM-西藥組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

3 討論

糖尿病潰瘍是糖尿病常見(jiàn)并發(fā)證之一，具有遷延不愈、反復(fù)發(fā)作等特點(diǎn)，給患者帶來(lái)極大的心理壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，是臨床急需解決的重要問(wèn)題之一[10]。糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合的過(guò)程是多因子共同參與的。分子輔助治療糖尿病潰瘍過(guò)程中，bFGF、EGF和VFGF三者均扮演著重要的作用[11]。bFGF可直接作用于其靶細(xì)胞，通過(guò)促有絲分裂反應(yīng)，使成纖維細(xì)胞分裂、增殖，起到促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。EGF是一種廣泛存在于人和動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞因子，EGF受體存在于多種細(xì)胞膜上,受體與EGF結(jié)合后形成受體-EGF復(fù)合物,通過(guò)自磷酸化等一系列生化反應(yīng)誘導(dǎo)或直接調(diào)控細(xì)胞增殖，從而啟動(dòng)創(chuàng)面修復(fù)的過(guò)程[12]。VEGF是一種特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的多功能細(xì)胞因子,它不僅能引起血管通透性增加、細(xì)胞外基質(zhì)成分改變，還能誘導(dǎo)新生血管形成[13-14]。

中藥的有效成分外用外治法是中醫(yī)治療糖尿病足的特色療法,在糖尿病潰瘍的研究中存在重要的臨床意義[15]。 丹黃散主要功效有活血化瘀、拔膿祛腐、托瘡生肌、利濕解毒等。方中丹參、大黃共為君藥，丹參不僅除了具有活血痛經(jīng)、清心除煩、保護(hù)心腦血管等作用，還具備促進(jìn)糖尿病潰瘍壞疽愈合、保肝、抗腫瘤、抗心肌缺血等作用[16]; 大黃的有效成分不僅具有抗腫瘤、輔助治療糖尿病腎病的作用，還可以保護(hù)膿毒癥胃腸功能衰竭患者，與此同時(shí)其提取物對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷也具有一定的保護(hù)作用[17]；當(dāng)歸為臣藥，能夠補(bǔ)氣活血，在抗腫瘤、糖尿病治療、血管性癡呆中發(fā)揮作用[18]；沒(méi)藥、沉香為佐藥，具有止痛、活血、抗菌消炎作用[19]；松香與丹參具有相似的促進(jìn)糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合的作用為使藥[20]。

(1)與DM組比較，P<0.05；(2)與DM-西藥組比較，P<0.05圖3 各組大鼠背部潰瘍新生肉芽組織中bFGF、EGF、VFGF蛋白表達(dá)Fig.3 The effect of Danhuang powder on the protein expression levels of bFGF, EGF and VEGF in newborn granulation tissues

本研究應(yīng)用將中藥丹黃散外敷于糖尿病大鼠潰瘍創(chuàng)面，利用中藥外治潰瘍，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，糖尿病潰瘍組大鼠血清中bFGF、EGF、VEGF較正常大鼠顯著降低，使用丹黃散外敷后，在大鼠血清及新生肉芽組織中bFGF、EGF、VFGF因子表達(dá)水平升高，表明丹黃散能夠上調(diào)3者的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)潰瘍創(chuàng)面的愈合，且效果優(yōu)于重組人EGF凝膠外敷。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)使用中藥丹黃散外敷能促進(jìn)于糖尿病大鼠潰瘍創(chuàng)面的愈合，可能是通過(guò)上調(diào)bFGF、EGF、VFGF的表達(dá)量的表達(dá)水平，促進(jìn)成纖維細(xì)胞和新生毛細(xì)血管增殖,改善創(chuàng)面的血液循環(huán),促進(jìn)肉芽組織生長(zhǎng)及肉芽組織在創(chuàng)面的填充,加快上皮細(xì)胞生長(zhǎng),最終加快創(chuàng)面愈合的進(jìn)程。這為促進(jìn)糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合的藥物開(kāi)發(fā)提供了新的參考依據(jù)，也為丹黃散促進(jìn)糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制提供新的理論基礎(chǔ)。