劉芳， 盧婷， 蔡夢迪， 吳芳草， 陳相好,3， 王彩霞， 崔古貞, 陳崢宏**

(1.貴州醫(yī)科大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院 微生物學教研室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省普通高等學校病原生物學特色重點實驗室， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州醫(yī)科大學 醫(yī)學檢驗學院， 貴州 貴陽 550004)

CRISPR-Cas9是近年發(fā)展起來的能夠在活細胞中進行基因組精確修飾的一種新技術(shù)，可快速實現(xiàn)基因的定點敲除、敲入、置換及突變等多項功能，被賦予生命科學領(lǐng)域“游戲規(guī)則改變者”的稱號[1-4]。CRISPR-Cas9系統(tǒng)主要由gRNA(指導RNA)和Cas9核酸酶兩大功能原件組成，gRNA作為“向?qū)А保哂刑禺愋?，可通過堿基互補配對原則識別DNA靶位點；Cas9核酸酶作為DNA“剪刀”，可以切割DNA靶位點，從而在靶位點引入DNA損傷。DNA損傷可以激發(fā)細胞自身的修復機制，從而實現(xiàn)基因的置換、敲除或敲入等多項功能[3,5]。目前，應用最廣泛的CRISPR-Cas9系統(tǒng)是來源于化膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)的CRISPR-Cas9系統(tǒng)[6]，該系統(tǒng)因其基因編輯效率高、打靶精度高、物種差異性低等特點，已在細菌[7-9]、真菌[10-13]、植物[14-15]、動物及人類[16-19]等多個物種中獲得廣泛應用。利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)在同一物種或不同物種中進行基因編輯或功能驗證時，往往需要大量Cas9特異性抗體檢測基因編輯的效果。因此，本文以來源于化膿鏈球菌的Cas9(Spy-Cas9)基因序列為模板，設(shè)計基因表達載體，并實現(xiàn)其在大腸桿菌中的大量表達；然后，以純化獲得的Spy-Cas9蛋白免疫新西蘭大白兔并純化獲得高質(zhì)量的多克隆抗體，為后續(xù)CRISPR-Cas9系統(tǒng)的機理研究和應用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株、質(zhì)粒和引物E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)購于天根生化科技有限公司，pWTCas9-NHEJ質(zhì)粒(攜帶化膿鏈球菌Cas9基因)由山東大學微生物學國家重點實驗室贈送，pET28a質(zhì)粒由本實驗室保存，PCR擴增Cas9基因所用引物PET28a-Cas9-F為GTCGACGGAGCTCGAATTCGTCAGTCACCTCCTAGCTG-ACTC，PET28a-Cas9-R為GTGGACAGCAAATGGGTCGCGGAATGGATAAGAAATACTCAATAG。

1.1.2主要試劑和儀器 無縫拼接試劑盒(pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit, CU101)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒與質(zhì)粒小提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，DNA聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，限制性內(nèi)切酶購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，His-Tag蛋白純化柱(ProteinIsoNi-NTA Resin)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，其他常規(guī)分子生物學試劑盒生化試劑均購自國藥有限公司。主要儀器包括PCR擴增儀(日本，BIO-Rad 10213型)，瓊脂糖凝膠電泳儀(北京市六一儀器制造廠，DYY-8C型)，蛋白電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，JY-SCZ2+)，核酸蛋白微量分析儀(ND2000)，凝膠成像分析儀(北京市六一儀器制造廠，WD-9413B型)，電熱恒溫水浴箱(北京，HH-W21-CR600型)，臺式高速離心機(上海安亭，TGL-16B)，超聲波破碎儀(寧波新芝生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1pET28a-Cas9表達載體的構(gòu)建 以pWTCas9-NHEJ質(zhì)粒為模板、PET28a-Cas9-F/PET28a-Cas9-R為引物，PCR擴增獲得Cas9基因全長序列；利用BamHI單酶切質(zhì)粒pET28a、無縫組裝試劑盒構(gòu)建pET28a-Cas9質(zhì)粒，將組裝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α；然后利用菌落PCR驗證目的質(zhì)粒 pET28a-Cas9，將驗證正確的質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行核酸序列測序。

1.2.2Cas9蛋白的誘導表達檢測 將質(zhì)粒pET28a-Cas9轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，挑取單菌落接種到4～5 mL含卡那霉素的LB液態(tài)培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min過夜培養(yǎng)，次日取菌液70μL接種到7 mL含卡那霉素的液態(tài)LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)至菌液OD600=0.5～0.6時，取1 mL菌液12 000 r/min，1 min，-20 ℃凍存沉淀；剩余菌液加入誘導劑IPTG至終濃度為1 mmol/L、37 ℃、180 r/min繼續(xù)培養(yǎng)，每隔1 h取樣檢測蛋白誘導表達情況。

1.2.3SDS-PAGE 取上述誘導表達的樣品進行SDS-PAGE檢測，SDS-PAGE檢測方法見參考文獻[20]。

1.2.4Cas9蛋白分離純化及優(yōu)化 取菌液50 μL接種于100 mL含卡那霉素的LB液態(tài)培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min過夜培養(yǎng)，次日將菌液全部移至1 L含卡那霉素的LB液態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)至菌液OD600=0.5～0.6時向其中加入誘導劑IPTG至終濃度為1 mmol/L，誘導3 h后收集菌體。棄上清，按每毫升菌體5～10 mL咪唑平衡緩沖液(10 mmol/L、pH 8.0)的比例重懸菌體，進行超聲波破碎(每次10 s、間隔10 s、破碎60 min)，然后離心30 min(4 ℃，12 000 r/min)取上清，再用0.45 μm孔徑的濾膜過濾上清。利用His-Tag技術(shù)進行純化：(1)裝柱(根據(jù)待純化蛋白量的多少，取適量介質(zhì)加入到層析柱中，靜置數(shù)分鐘待液體流盡)，(2)平衡層析柱[取5～10倍柱體積的(10 mmol/L、pH 8.0)咪唑平衡緩沖液于層析柱中，靜置數(shù)分鐘待液體流盡]，(3)上樣(將樣品少量多次加入到層析柱，靜置3 min左右再流出)，(4)洗滌蛋白，收集流出液[上樣結(jié)束之后，少量多次加入5～10倍純化介質(zhì)(10 mmol/L、pH 8.0)的咪唑平衡緩沖液]，(5)洗脫目的蛋白(用含10mmol/L、20mmol/L、50mmol/L不同咪唑濃度的平衡緩沖液依次洗脫10個柱體積)，(6)用500 mmol/L的咪唑濃度平衡緩沖液(pH 8.0)洗脫5個柱體積，期間靜置30 min，收集流出液并進行SDS-PAGE電泳檢測純化效果。

1.2.5多克隆抗體制備及效價測定 (1)動物免疫，選用4月齡健康雌性新西蘭大白兔，體質(zhì)量2.1 kg。第1次免疫使用弗氏完全佐劑，第2、3、4次免疫使用弗氏不完全佐劑。免疫過程如下：第1次免疫后的第21天、35天進行第2、3次免疫，第3次免疫后的1周時(第42天)采集兔耳靜脈血1 mL、ELISA檢測抗血清效價；在第49天進行第4次免疫，之后1周時采集兔耳靜脈血1 mL、ELISA檢測抗血清效價，第57天時進行頸動脈采血檢測相同指標。(2)間接ELISA檢測抗血清效價，將抗原用碳酸鹽(0.05 mol/L、pH=9.6)按0.2 μg/孔包板，4 ℃孵育過夜；取出，用0.05%Tween-20洗板3次(3 min/次)，每孔加入100 μL含5%脫脂奶粉的封閉液，37℃、封閉60 min，洗板3次后加一抗(將兔子的血清分別按照1∶1 000倍比稀釋，37 ℃ 孵育1 h)，洗板3次后加二抗(辣根酶標記山羊抗兔IgG，按照1∶8 000倍比稀釋，37 ℃孵育45 min)，洗板3次后加入底物溶液(100 μL/孔)，反應15 min，再加入100 μL硫酸(2 mol/L)終止反應，使用酶標儀(科華ST-360)在450 nm波長下測定OD值。

2 結(jié)果

2.1 pET28a-Cas9質(zhì)粒構(gòu)建及驗證

利用無縫組裝試劑盒將PCR擴增獲得的約4.1 kb的目的片段與經(jīng)BamHI單酶切pET28a載體組裝(圖1a、1c)，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，利用特異性引物PET28a-Cas9-F/PET28a-Cas9-R進行菌落PCR驗證。菌落PCR結(jié)果表明，獲得的單一目的條帶與預期大小一致(圖1b)。DNA測序表明成功構(gòu)建Cas9表達載體pET28a-Cas9。

注：M為Trans2K Plus II DNA Marker；A為pET28a酶切電泳圖及Cas9基因PCR擴增，泳道1為pET28a經(jīng) BamHI 單酶切，泳道2～3為Cas9基因PCR擴增條帶；B為菌落PCR凝膠電泳圖，泳道1～3為菌落PCR擴增Cas9基因條帶，C為pET28a-Cas9質(zhì)粒圖圖1 pET28a-Cas9質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定Fig.1 Construction and identification of pET28a-Cas9 plasmid

2.2 Cas9蛋白誘導表達

將測序驗證正確的pET28a-Cas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，1 mmoL IPTG誘導表達，超聲破碎后離心取上清進行SDS-PAGE電泳檢測。圖2所示，在約160 kDa處出現(xiàn)特異性條帶，隨著誘導時間的延長，濃度逐漸增加，而空載體并沒有特異性條帶出現(xiàn)，表明Cas9獲得成功表達。

注：M為Blue Plus II Protein Marker，泳道1為pET28a-Cas9 轉(zhuǎn)BL21(DE3)后未加IPTG，泳道2～6為pET28a-Cas9轉(zhuǎn) BL21(DE3)后經(jīng)IPTG誘導分別依次隔1 h取樣(泳道2、 3、4、5及6分別為IPTG誘導1、2、3、4及5 h)，泳道7為 pET28a空質(zhì)粒轉(zhuǎn)BL21(DE3)后未加IPTG，泳道8～ 10為pET28a空質(zhì)粒轉(zhuǎn)BL21(DE3)后經(jīng)IPTG誘 導于1、2及3 h時取樣圖2 Cas9蛋白的誘導表達Fig.2 Induced expression of Cas9

2.3 Cas9蛋白的分離純化及優(yōu)化

將分離純化得到的 Cas9蛋白洗脫液用SDS-PAGE進行檢測，圖3所示，洗脫的第2～5柱體積蛋白濃度較高、純度較好，適合用于后續(xù)抗體的制備。

注：M為Blue Plus II Protein Marker，泳道1為未純化的 細胞破碎上清液，泳道2～10為使用500 mmol/L 咪唑濃度緩沖液依次洗脫的樣品圖3 Cas9蛋白的分離純化Fig.3 Isolation and purification of Cas9 protein

2.4 Cas9抗體制備及ELISA效價檢測

利用優(yōu)化的Cas9蛋白純化方法大量制備Cas9蛋白，然后分別免疫健康雌性新西蘭大白兔A、B、C、D，經(jīng)過3次免疫后4只雌性新西蘭大白兔抗血清效價分別為A≥64 K、B≥32 K、C≥32 K、D≥32 K；在第57天時進行頸動脈采血后抗血清效價分別為A≥512 K、B≥64 K、C≥64 K、D≥512 K(表1)；最后將獲得的血清進行純化，純化抗體的效價分別為 A≥128 K、B≥128 K、C≥256 K、D≥256 K(表2)。

表1 在第57天時頸動脈血標本抗血清效價(OD450)Tab.1 Anti-serum titer detection after carotid blood collection on day 57

注：K表示“千”，血清效價值為≥2.5×陰性值

表2 純化抗體效價檢測(OD450)Tab.2 Purified antibody titer assay

注：K表示“千”，血清效價值為≥2.5×陰性值

3 討論

Cas9蛋白是CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)的一個重要原件，約為160 kDa，普遍存在于細菌體內(nèi)。野生型細菌內(nèi)Cas9蛋白表達量較低，不足夠用于研究，因此通過構(gòu)建表達載體使Cas9蛋白在細菌體內(nèi)大量表達。大腸桿菌存在多種蛋白的表達基因，在經(jīng)過IPTG誘導后會表達出除Cas9蛋白之外的許多雜蛋白，其表達和分離純化存在一定的困難。目前雖有商業(yè)銷售的Cas9蛋白抗體，但價格昂貴[21-23]。本文通過優(yōu)化純化條件，最終獲得了較高純度的Cas9蛋白，并以此免疫新西蘭大白兔，獲得多克隆抗體。然而，本研究獲得的多克隆抗體其效價不高、且抗體純化后的效價低于血清效價，這可能與免疫的動物類型、免疫時間間隔、免疫劑量、抗體純化方法等多種因素有關(guān)。因此，在后續(xù)的研究中，本研究將進一步優(yōu)化抗體制備流程，為CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)提供更優(yōu)良的抗體。