李 迎,宋 宇,張?zhí)扃?王璐璐,黃曉迪，宋玉國*

(1.北華大學(xué)附屬醫(yī)院,吉林 吉林132011；2.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院；3.吉林市中心醫(yī)院；4.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院)

銀屑病(psoriasis)是一種由免疫介導(dǎo)的、慢性全身性疾病,世界范圍內(nèi)其發(fā)病率為0.9%-8.5%[1,2]。根據(jù)臨床特征,銀屑病可分為尋常型、關(guān)節(jié)病型、膿皰型和紅皮病型,其中尋常型銀屑病占99%以上。臨床表現(xiàn)以紅色丘疹或斑丘疹開始,逐漸發(fā)展為持續(xù)性炎癥和表皮增生,通常發(fā)生于頭皮、肘部、膝蓋、臍部和腰部[3,4]。病理學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)皮損處有淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤,尤其以T淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞在表皮或真皮浸潤。一些研究進(jìn)一步證實(shí)T輔助細(xì)胞(Th)17和Th1細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥是銀屑病的關(guān)鍵[5,6]。還有文獻(xiàn)報(bào)道,CD3+CD4-CD-T細(xì)胞在銀屑病致病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[7]。因此,本文對(duì)尋常型銀屑病患者進(jìn)行了外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測,旨在為臨床評(píng)價(jià)患者細(xì)胞免疫功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

銀屑病患者34例均來自北華大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科,其中男20例,女14例,年齡(39.77±17.46)歲,全部病例符合銀屑病診斷標(biāo)準(zhǔn),且均為初診的尋常型銀屑病患者,未用免疫抑制劑及糖皮質(zhì)激素等藥物治療,無病原微生物感染等其它病史。健康對(duì)照組30例均來自北華大學(xué)附屬醫(yī)院健康體檢中心,其中男17例,女13例,年齡(36.47±9.89)歲,近期均無病原微生物感染、過敏和皮膚病等相關(guān)病史。兩組在性別和年齡方面均具有可比性。

1.2 標(biāo)本采集

清晨空腹采集靜脈血2 ml,EDTA-K2抗凝,立即送檢。

1.3 主要儀器和試劑

流式細(xì)胞儀,美國Beckman Coulter Epics XL型,用于檢測T淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞；血球計(jì)數(shù)儀,用于檢測外周血淋巴細(xì)胞百分率和絕對(duì)值。熒光抗體：CD3-PC5、CD4-FITC、CD8-PE,CD3-FITC/CD(16+56)-PE,美國Beckman Coulter公司。

1.4 淋巴細(xì)胞亞群檢測

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測T淋巴細(xì)胞亞群和自然殺傷(NK)細(xì)胞。在T淋巴細(xì)胞亞群檢測試管中加入三種熒光抗體CD3-PC5、CD4-FITC、CD8-PE各20 μl,在NK細(xì)胞檢測試管中加入CD3-FITC/CD(16+56)-PE雙色熒光抗體,分別加入被測抗凝血100 μl,混合均勻,室溫避光標(biāo)記15 min。加入溶血?jiǎng)〢600 μl,震蕩7秒,再加入溶血?jiǎng)〣260 μl,混勻。溶解紅細(xì)胞后,1 000 rpm 離心5 min,棄上清,加入PBS緩沖液4 ml,重新混勻,1 000 rpm 離心5 min,棄去上清。加入PBS緩沖液500 μl,混勻,應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。此方法檢測結(jié)果為T淋巴細(xì)胞總數(shù)(CD3+T細(xì)胞)、輔助性T淋巴細(xì)胞(CD4+T細(xì)胞)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CD8+T細(xì)胞)和自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)的百分率。此百分率乘以淋巴細(xì)胞絕對(duì)值即可計(jì)算出各淋巴細(xì)胞亞群的絕對(duì)值(cells/μl)。CD3+T細(xì)胞數(shù)減去CD4+T細(xì)胞數(shù)再減去CD8+T細(xì)胞數(shù)即為CD3+ CD4-CD8-T細(xì)胞數(shù)(包括百分率和絕對(duì)值)。

1.5 淋巴細(xì)胞絕對(duì)值檢測

應(yīng)用血球計(jì)數(shù)儀進(jìn)行檢測,單位是cells/μl。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用spss19.0軟件對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行分析,各組間的比較采用兩樣本t檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)進(jìn)行Logistic回歸分析(Logistic regression analysis)。我們用t檢驗(yàn)比較銀屑病患者和對(duì)照組之間的年齡差異,用χ2檢驗(yàn)比較銀屑病患者和對(duì)照組之間的性別差異。采用Logistic回歸模型分析各亞群細(xì)胞數(shù)量和百分率,估計(jì)銀屑病發(fā)生率與對(duì)照組的優(yōu)勢比。為了解釋Logistic回歸分析的結(jié)果,我們計(jì)算了OR-1,并以%表示。由于自變量是連續(xù)的,如果自變量增加大約1個(gè)單位(1個(gè)細(xì)胞/μl或1個(gè)百分點(diǎn)),我們得到了銀屑病風(fēng)險(xiǎn)的平均百分比變化。

2 結(jié)果

2.1 研究組特點(diǎn)

銀屑病患者34例,正常對(duì)照組30例,兩組的年齡(t=1.0057,P=0.3497)和性別(χ2=0.0304,P=0.8616),差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 銀屑病患者組和正常對(duì)照組T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量比較

銀屑病患者組34例和正常對(duì)照組30例全部檢測了T淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞百分率,T淋巴細(xì)胞亞群包括CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞。通過計(jì)算得到了以上各細(xì)胞亞群的絕對(duì)值(cells/μl)、CD3+ CD4- CD8-細(xì)胞的百分率和絕對(duì)值以及CD4/CD8比值。對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)的t檢驗(yàn)分析(見表1)。結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,CD3+T細(xì)胞的百分率和絕對(duì)值明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；CD4+T細(xì)胞的百分率高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而CD4+T細(xì)胞的絕對(duì)值明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)； CD8+T細(xì)胞的百分率與對(duì)照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但其細(xì)胞絕對(duì)值高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CD3+ CD4- CD8-細(xì)胞的百分率高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其細(xì)胞絕對(duì)值明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；CD4/CD8比值略高于對(duì)照組,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩組比較,NK細(xì)胞的百分率和絕對(duì)值均無明顯差異(P>0.05)。

表1 銀屑病患者與正常對(duì)照組細(xì)胞亞群統(tǒng)計(jì)分析(t檢驗(yàn)和Logistic回歸分析)

3 討論

銀屑病是一種免疫介導(dǎo)的慢性炎癥性皮膚病,臨床表現(xiàn)為鱗屑性紅斑或斑塊,局限分布或全身廣泛分布。病理學(xué)檢查證實(shí),銀屑病皮損處淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤明顯,其中浸潤的淋巴細(xì)胞以T細(xì)胞為主。近期的研究表明,血液內(nèi)和/或皮膚中的T淋巴細(xì)胞異常活化或免疫調(diào)節(jié)抑制作用受阻,導(dǎo)致皮膚發(fā)生炎癥反應(yīng)和角質(zhì)形成細(xì)胞過度增生[8],表現(xiàn)為紅色丘疹或斑丘疹樣皮損,逐漸擴(kuò)展為紅色斑塊,上面覆蓋厚層銀白色鱗屑。

因?yàn)殂y屑病的發(fā)病機(jī)制與T淋巴細(xì)胞的變化密切相關(guān),所以本文研究了銀屑病患者外周血中T淋巴細(xì)胞亞群的變化情況。其中淋巴細(xì)胞亞群包括輔助性T淋巴細(xì)胞(CD4+T細(xì)胞)、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD8+T細(xì)胞)、CD3+CD4-CD8-T細(xì)胞,同時(shí)將自然殺傷細(xì)胞亦作為常見淋巴細(xì)胞亞群也進(jìn)行了分析。T淋巴細(xì)胞亞群的變化情況,本文將銀屑病患者與正常對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比研究,包括各淋巴細(xì)胞亞群的百分率(%)變化及在外周血中絕對(duì)值的變化(cell/ul)。在數(shù)據(jù)分析方面,本文應(yīng)用t檢驗(yàn)分析了兩組數(shù)據(jù)的差異性,采用Logistic回歸分析模型,統(tǒng)計(jì)分析了銀屑病發(fā)生率與對(duì)照組的優(yōu)勢比,使用獨(dú)立變量(百分率為第一模型,絕對(duì)數(shù)為第二模型)進(jìn)行分析。為了便于解釋Logistic回歸分析結(jié)果,我們計(jì)算了OR-1,并以百分?jǐn)?shù)(%)表示。以百分率變化和絕對(duì)值變化為自變量,由于自變量是連續(xù)的,如果自變量增大約1個(gè)單位(第一種模型中1個(gè)百分點(diǎn),第二種模型為1cell/ul),我們得到了銀屑病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)性的百分比變化,包括正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。

我們發(fā)現(xiàn),與正常對(duì)照組比較銀屑病組T淋巴細(xì)胞亞群中,CD3+T淋巴細(xì)胞的百分率和絕對(duì)值均明顯升高(P<0.01)；CD4+、CD3+CD4-CD8-T細(xì)胞的百分率高于對(duì)照組(P<0.05),但其絕對(duì)值明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)；CD8+T細(xì)胞的百分率無顯著差異,其絕對(duì)值高于正常對(duì)照組(P<0.05)。為了更確切地比較哪個(gè)T細(xì)胞亞群是銀屑病致病的危險(xiǎn)因素,通過Logistic回歸分析,我們發(fā)現(xiàn)CD3+、CD4+、CD3+CD4-CD8-T細(xì)胞百分率以及CD4/CD8的比值與銀屑病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān),其指標(biāo)每增加1個(gè)單位,銀屑病的患病患病風(fēng)險(xiǎn)分別增加22.9%、12.2%、31.9%和116.7%。

T細(xì)胞的主要作用是介導(dǎo)細(xì)胞免疫,調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能。CD3+T細(xì)胞代表T淋巴細(xì)胞總數(shù),依其主要細(xì)胞表面分化的抗原不同,進(jìn)一步分為CD4+T細(xì)胞(輔助性T細(xì)胞)和CD8+T細(xì)胞(細(xì)胞表性T細(xì)胞)兩個(gè)亞群。CD4+T細(xì)胞又分為Th1、Th2和Th17三個(gè)亞群,分別作用于M4、B細(xì)胞和炎癥細(xì)胞,參與細(xì)胞免疫、體液免疫和炎癥反應(yīng)。其中Th17細(xì)胞亞群通過分泌IL-17、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子參與調(diào)控炎癥反應(yīng)和自身免疫,也是銀屑病的主要發(fā)病機(jī)制之一。通過細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路研究發(fā)現(xiàn)[9],Notch1信號(hào)通過調(diào)控Th17細(xì)胞的分化和功能,在銀屑病的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用；采取一定措施阻斷Notch1信號(hào)通路,可以減輕Th17細(xì)胞在銀屑病中的致炎作用。外周血T細(xì)胞,包括CD4+和CD8+T細(xì)胞在免疫原持續(xù)刺激后參與銀屑病的發(fā)生[10]。已有研究發(fā)現(xiàn),在銀屑病的皮損中CD4+T細(xì)胞主要積聚在真皮中,而CD8+T細(xì)胞主要積聚在表皮中,CD4+T細(xì)胞在皮膚炎癥發(fā)生及角質(zhì)形成細(xì)胞過度增生中發(fā)揮主導(dǎo)作用。本文的研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道基本一致,發(fā)現(xiàn)在本文入選的銀屑病患者外周血中,CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞明顯高于正常對(duì)照組,其中CD3+T細(xì)胞的增多可能是由于CD4+T細(xì)胞的增多而導(dǎo)致的。通過Logistic回歸分析表明CD3+細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞是銀屑病的危險(xiǎn)致病因素。在本文的研究中,也發(fā)現(xiàn)銀屑病患者外周血中CD3+CD4-CD8-T細(xì)胞亦明顯高于正常對(duì)照組,表明了這類細(xì)胞是銀屑病危險(xiǎn)致病因素。CD3+CD4-CD8-T細(xì)胞是表達(dá)γδTCR的CD3+T細(xì)胞,Cai Y[11]等報(bào)道,銀屑病患者表達(dá)γδTCR的CD3+T細(xì)胞明顯高于正常對(duì)照組,本文與該報(bào)道相似。

總之,銀屑病病變是由不同類型細(xì)胞之間相互作用以及包括IL-17、TNF-α、IL-6和IL-23在內(nèi)的多種細(xì)胞因子引起的,需要在T淋巴細(xì)胞活化、調(diào)節(jié)以及IL-23/ IL-17調(diào)節(jié)軸等方面進(jìn)行深入研究,才能為銀屑病的診斷和治療提供免疫學(xué)數(shù)據(jù)支撐。