■李莉娜 張林鑫 張凱凱 陳浩林 粟朝芝 吳 仙

(貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州貴陽550003)

菜籽粕是油菜籽提油之后的副產(chǎn)物，粗蛋白質(zhì)含量約35%～45%，氨基酸組成相對均衡，且Ca、Mg等礦物質(zhì)及維生素B、膽堿等維生素含量高，是一種具較高營養(yǎng)價值的植物蛋白資源[1]。然而因天然餅粕中含有多種抗營養(yǎng)因子，所以限制了菜籽粕在飼料工業(yè)的應(yīng)用，相當一部分還被加工成有機肥料使用，大大浪費了菜籽粕營養(yǎng)價值的利用[2]。為了去除菜籽粕中硫甙、植酸、單寧等有毒物質(zhì)和抗營養(yǎng)因子，提高其在動物飼料中的飼用價值，國內(nèi)外學者進行了大量的研究。目前，在眾多處理方法中，固態(tài)發(fā)酵菜籽粕已成為研究熱點。很多研究報道表明微生物固態(tài)發(fā)酵可以改善菜籽粕的營養(yǎng)特性或飼用價值[3-6]。由于各原料的營養(yǎng)特性和實際應(yīng)用的限制因素不同及發(fā)酵所選用的菌種或發(fā)酵方式不同，改善效果也存在不一致[7-8]。因此，本試驗以菜籽粕為底物，選用枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌、糞鏈球菌等菌種，通過單菌株與混菌株固體發(fā)酵試驗，研究菜籽粕發(fā)酵產(chǎn)品的理化性質(zhì)。旨在通過菜籽粕的微生物固態(tài)發(fā)酵改善其營養(yǎng)價值，為其在動物飼料中的合理使用提供基礎(chǔ)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菜籽粕、玉米粉和麥麩：菜籽粕購自貴州金瑞農(nóng)業(yè)科技有限公司，麥麩和玉米粉購自貴州五斗米商貿(mào)有限公司，烘干，用高速超微粉碎機粉碎，過60 目篩保存?zhèn)溆谩?/p>

無水氯化鈣：分子式CaCl2，分子量110.9，純度≥96.0%，成都金山化學試劑有限公司。

氯化銨：分子式NH4Cl，分子量53.49，純度≥99.5%，天津市永大化學試劑有限公司。

1.2 菌種

查閱文獻選擇枯草芽孢桿菌、黑曲霉、釀酒酵母、植物乳桿菌和糞鏈球菌發(fā)酵菜籽粕，分別在中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院(中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，CICC)和中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心(ACCC)購買，具體參數(shù)見表1。

表1 5種菌的基本信息

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 菌種活化培養(yǎng)基

①枯草芽孢桿菌活化培養(yǎng)基：麩皮50.0 g、豆餅粉30.0 g。上述成分混合后，加0.2%NaOH溶液1.0 L，煮沸1 h，用HCl中和到pH值7，然后加瓊脂20.0 g，熔化后，分裝滅菌。37 ℃培養(yǎng)1～2 d。

②植物乳桿菌活化培養(yǎng)基：酪胨10.0 g、牛肉粉8.0 g、酵母粉4.0 g、葡萄糖20.0 g、硫酸鎂0.2 g、乙酸鈉5.0 g、檸檬酸三銨2.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、硫酸錳0.05 g、吐溫80 1.0 g，蒸餾水1 000 ml。pH 值6.2±0.2。37 ℃培養(yǎng)1～2 d。

③釀酒酵母活化培養(yǎng)基：5°Bé 麥芽汁瓊脂(青島海博生物技術(shù)有限公司HB4176-2)1.0 L，瓊脂15.0 g制備，自然pH值。28～30 ℃培養(yǎng)3 d。

④糞鏈球菌活化培養(yǎng)基：酪蛋白胨10.0 g、牛肉提取物10.0 g、酵母提取物5.0 g、葡萄糖5.0 g、乙酸鈉5.0 g、檸檬酸二銨2.0 g、吐溫801.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、7 水硫酸鎂0.02 g、1 水硫酸錳0.05 g、碳酸鈣20.0 g、瓊脂15.0 g、蒸餾水1.0 L。pH 值6.2±0.2。37 ℃培養(yǎng)1～2 d。

⑤黑曲霉活化培養(yǎng)基：馬鈴薯提取液1.0 L，葡萄糖20.0 g、瓊脂15.0 g，pH 值自然。馬鈴薯提取液：取去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加水1.0 L煮沸30 min，濾去馬鈴薯塊，將濾液補足至1.0 L。28～30 ℃培養(yǎng)5～7 d。

1.3.2 固體發(fā)酵培養(yǎng)基

在250 ml三角瓶中加入菜籽粕20 g、CaCl20.1%、NH4Cl 1.5%、玉米粉0.5%、麥麩0.5%、料水比1∶1.2攪拌均勻，121 ℃高壓滅菌15 min后備用。

1.4 試驗方法

1.4.1 單菌固體發(fā)酵菜籽粕試驗

將枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌、釀酒酵母、糞鏈球菌、黑曲霉打管復活，分別在液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，按30%接種量分別接種到固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻，密封放入30 ℃培養(yǎng)箱中連續(xù)恒溫培養(yǎng)3 d，設(shè)3個重復。發(fā)酵產(chǎn)品在35 ℃烘干，粉碎過60 目篩備用。測定有益菌活菌總數(shù)、真蛋白質(zhì)量分數(shù)、硫苷含量、多肽得率、氨基酸和單寧含量，同時測定原料真蛋白質(zhì)量分數(shù)、硫苷含量、氨基酸和單寧含量。

1.4.2 混菌固體發(fā)酵菜籽粕試驗

根據(jù)單菌發(fā)酵試驗測定指標的結(jié)果，選擇真蛋白質(zhì)量分數(shù)較高、硫苷含量最低和多肽得率最高的4個菌種，分別在液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，合理組合(雙菌、三菌、四菌)，分成10 個菌種組合，按1∶1，1∶1∶1，1∶1∶1∶1的比例、30%總接種量接種到固體發(fā)酵培養(yǎng)基中混合發(fā)酵，攪拌均勻，密封放入30 ℃培養(yǎng)箱中連續(xù)恒溫培養(yǎng)3 d，設(shè)3個重復。發(fā)酵產(chǎn)品在35 ℃下烘干，粉碎過60目篩備用。測定其有益菌活菌總數(shù)、真蛋白質(zhì)量分數(shù)、硫苷含量、多肽得率、氨基酸和單寧含量。

1.5 檢測方法

有益菌活菌總數(shù)參照劉寶生等(2011)[9]枯草芽孢桿菌活菌數(shù)的測定方法；氨基酸含量參照NY/T 1582—2007 油菜籽中硫代葡萄糖苷的測定高效液相色譜法[10]；真蛋白質(zhì)量分數(shù)參照王俊峰(2004)[11]飼料中真蛋白質(zhì)含量的測定方法；硫苷含量參照汪正華(2000)的氯化鈀分光光度法[12]；單寧含量參照GB/T 27985—2011飼料中單寧的分光光度測定方法[13]；多肽得率參照魯偉(2005)蛋白水解液中多肽含量的測定方法[14]。

1.6 數(shù)據(jù)分析處理

利用SAS 9.1 軟件進行數(shù)據(jù)的差異顯著性檢驗，各指標以“平均數(shù)±標準差”表示。各組間差異顯著性用Duncan's 方法進行比較。指標差異顯著判斷標準為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 原料理化分析結(jié)果

原料菜籽粕在干物質(zhì)基礎(chǔ)上，粗蛋白為34.97%、粗脂肪為4.63%、灰分為7.23%、鈣為0.67%、磷為1.32%、真蛋白質(zhì)量分數(shù)為31.81%、氨基酸含量271.17 mg/g、硫苷含量22.51 μmol/g、單寧的含量11.36 μg/g。

2.2 單菌株發(fā)酵產(chǎn)品理化分析結(jié)果

單菌株發(fā)酵菜籽粕結(jié)果見圖1、圖2、圖3、圖4、圖5、圖6，發(fā)酵后有益活菌總數(shù)從大到小為：D＞A＞C＞E＞B，釀酒酵母比其他菌種發(fā)酵后有益活菌總數(shù)高，為3.85×107cfu/g(P＜0.05)達到差異顯著水平；各單菌株發(fā)酵后真蛋白質(zhì)量分數(shù)為：A＞E＞D＞C＞B，枯草芽孢桿菌發(fā)酵真蛋白質(zhì)量分數(shù)最高為39.51%，與原料相比提高了7.7 個百分點；發(fā)酵后氨基酸含量從大到小為：A＞C＞E＞D＞B，枯草芽孢桿菌發(fā)酵后氨基酸含量最高為296.41 mg/g，與原料相比提高了25.24 個百分點；發(fā)酵后多肽得率從大到小為：C＞D＞A＞E＞B，糞鏈球菌發(fā)酵后多肽得率最高為16.04%，與D 差異不顯著，但與A、B、E 之間差異顯著(P＜0.05)；發(fā)酵后硫苷含量從大到小為：B＞E＞C＞D＞A，其中枯草芽孢桿菌和釀酒酵母具有較高的硫苷降解能力，兩者之間差異不顯著，但與未發(fā)酵菜籽粕的硫苷含量相比，硫苷降解了10.68 個百分點；發(fā)酵后單寧含量從大到小為：B＞A＞C＞D＞E，黑曲霉發(fā)酵后最低為7.519 7 μg/g，與原料相比降低了3.84 個百分點。綜合上述結(jié)果，選擇降解硫苷能力強的A、有益活菌總數(shù)多的D、生產(chǎn)多肽最多的C 以及降解單寧強的E，進行雙菌、三菌、四菌混菌發(fā)酵試驗。

圖1 單菌株發(fā)酵有益活菌總數(shù)

圖2 單菌株發(fā)酵真蛋白質(zhì)量分數(shù)

圖3 單菌株發(fā)酵總氨基酸含量

圖4 單菌株發(fā)酵多肽得率

圖5 單菌株發(fā)酵硫苷含量

圖6 單菌株發(fā)酵單寧含量

2.3 混菌株發(fā)酵產(chǎn)品理化分析結(jié)果

混菌株發(fā)酵菜籽粕見圖7、圖8、圖9、圖10、圖11、圖12，有益活菌總數(shù)中，B+C+D 組合最高為5.89×107cfu/g，其次C+D為5.50 cfu/g、A+B+C為5.22 cfu/g、A+B+D為4.54 cfu/g，四者之間差異不顯著，但與其他組合相比，達到差異顯著水平（P＜0.05）；真蛋白質(zhì)量分數(shù)中，A+B 組合最高為45.79%，其次A+B+C+D 為45.69%，A+D 為45.68%，三個組合之間差異不顯著，但與其他組合相比，均達到差異顯著水平（P＜0.05）；氨基酸含量中，最高的組合是A+B+C+D為331.48 mg/g，其次B+C+D 組合為330.10 mg/g，兩者之間差異不顯著，但與其他組合相比，均達到差異顯著水平（P＜0.05）；多肽得率最高的C+D組合為26.31%，其次B+D為24.78%，兩者之間差異不顯著，但與其他組合相比，均達到差異顯著水平（P＜0.05）；硫苷含量中，降解能力最強的A+B+C+D 組合達到10.32 μmol/g，其次是B+C+D 為10.56 μmol/g、A+B+D 為11.21 μmol/g，三者之間差異不顯著，但與其他組合相比，均達到差異顯著水平（P＜0.05）；單寧含量中，降解最強的A+B+C+D組合達到5.61 μg/g，其次是A+B 為5.62 μg/g、B+C+D 為5.63 μg/g、A+B+D為5.69 μg/g，四者之間差異不顯著，但與其他組合相比，均達到差異顯著水平(P＜0.05)。

圖7 混菌株發(fā)酵有益活菌總數(shù)

圖8 混菌株發(fā)酵真蛋白質(zhì)量分數(shù)

圖9 混菌株發(fā)酵氨基酸含量

圖10 混菌株發(fā)酵多肽得率

圖11 混菌株發(fā)酵硫苷含量

圖12 混菌株發(fā)酵單寧含量

3 討論

3.1 單菌發(fā)酵試驗對菜籽粕的影響

枯草芽孢桿菌菌體自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類，在消化道中與動物體內(nèi)的消化酶類一同發(fā)揮作用。本研究表明枯草芽孢桿菌發(fā)酵菜籽粕的效果顯著優(yōu)于其他單菌，真蛋白質(zhì)量分數(shù)提高了39.51%，總氨基酸含量提高了9.31%，可能是菌株利用氮源合成了菌體蛋白的原因。多肽得率為15.27%，硫苷為45.51%，這與何榮海等[15]用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵菜籽粕生產(chǎn)多肽及降解硫苷的研究結(jié)果接近，多肽得率15.94%，硫苷降解率可達62.14%。菜籽粕經(jīng)過植物乳桿菌、黑曲霉處理后其抗營養(yǎng)因子均得到大幅度降解，其中黑曲霉的降解率高于植物乳桿菌，在改善菜籽粕營養(yǎng)品質(zhì)方面植物乳桿菌效果優(yōu)于黑曲霉。這與邱良偉等[16]的研究報道一致。

3.2 混菌發(fā)酵試驗對菜籽粕的影響

混菌發(fā)酵的原理是利用微生物種類多，數(shù)量大，繁殖快，易培養(yǎng)，酶系復雜等特點，采用發(fā)酵技術(shù)來去除菜籽粕中的抗營養(yǎng)因子[17]，不僅可以去除大部分抗營養(yǎng)因子，而且混菌發(fā)酵效果顯著優(yōu)于單菌發(fā)酵效果[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，B+C+D 組合有益活菌總數(shù)最高為5.89×107cfu/g；A+B組合的真蛋白質(zhì)量分數(shù)最高為45.79%；A+B+C+D 組合的氨基酸含量最高為331.48 mg/g；C+D 組合的多肽得率最高為26.31%；A+B+C+D 組合降解硫苷能力最強達到10.32 μmol/g；A+B+C+D組合降解單寧最強的達到5.61 μg/g。與原料菜籽粕相比，真蛋白質(zhì)量分數(shù)提高了13.98 個百分點，氨基酸含量提高了18.19%，硫苷含量降低了54.15%，單寧的含量降低了50.62%。這一結(jié)果與前人的研究不一致，張宗舟等[19]通過發(fā)酵法可使菜籽粕單寧分解率達到93.7%；孫林[20]采用植物乳酸菌、蠟樣芽孢桿菌、酪酸梭狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌添加麩皮發(fā)酵菜籽粕48 h，菜籽粕單寧去除率達77.3%；胡永娜等[4]利用枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和啤酒酵母三菌種組合發(fā)酵菜籽粕。菜籽粕硫苷93.44%、單寧降解率34.86%?？赡苁且驗槎嗑l(fā)酵時多菌體系中微生物生長狀況良好，使發(fā)酵產(chǎn)物中的菌體數(shù)目增多。但是單寧含量沒有明顯降低，原因可能有兩個：一是因為試驗保證總接種量不變，每種菌的接種量相對減少，因此影響了發(fā)酵的總體效果；二是因為菌種之間可能存在拮抗作用。硫苷的降解效果明顯，主要是霉菌和酵母菌混合培養(yǎng)時，酵母能較快地利用基質(zhì)中的可發(fā)酵性糖生長繁殖合成菌體蛋白，起到解除終產(chǎn)物阻遏作用，使霉菌能不斷分泌產(chǎn)生淀粉酶、糖化酶、纖維素酶等，從而有效地分解碳水化合物，提高了硫苷的降解率。

4 結(jié)論

①單菌發(fā)酵中，枯草芽孢桿菌發(fā)酵效果顯著優(yōu)于其他單菌，明顯提高了真蛋白質(zhì)量分數(shù)和氨基酸含量，降低了抗營養(yǎng)因子含量。

②混菌發(fā)酵中，枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、糞鏈球菌和黑曲霉的四菌組合發(fā)酵效果最好。