■王洪超 穆春玲 劉大森 辛杭書 李忠秋 劉春龍

（1.中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，黑龍江哈爾濱150081；2.琿春市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，吉林琿春133300；3.琿春市英安鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，吉林琿春133300；4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；5.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，黑龍江哈爾濱150086）

體外發(fā)酵技術(shù)是模擬瘤胃液對(duì)飼料進(jìn)行體外發(fā)酵培養(yǎng)，體外培養(yǎng)環(huán)境接近瘤胃內(nèi)發(fā)酵環(huán)境。運(yùn)用此方法的最大優(yōu)點(diǎn)就是不受試驗(yàn)動(dòng)物的條件限制，可以很容易的在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行，因此得到了廣泛的應(yīng)用。油菜含有雙高既高芥酸和高硫代葡萄糖甙這兩種物質(zhì)，導(dǎo)致其含有辛辣味而且如果畜禽過量采食，會(huì)引起新陳代謝紊亂引發(fā)甲狀腺腫大。甚者導(dǎo)致家畜死亡[1]。經(jīng)過研究，傳統(tǒng)油菜改良成含有低芥酸、低硫代葡萄糖甙的油飼兼用品種，又名飼料油菜。飼料油菜具有生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高的特點(diǎn)，平均鮮草產(chǎn)量為49 747.5 kg/hm2，最高可達(dá)74 550 kg/hm2[2]，飼用增重效果明顯[3]。其蛋白含量為25.6%，粗脂肪2.4%[4]，營養(yǎng)價(jià)值很高?？梢宰鳛閮?yōu)質(zhì)的青粗飼料[5]。飼料油菜的耐寒性很強(qiáng)[6]，易于推廣，在晚秋種植，既能延長(zhǎng)青綠飼料供給期還能解決牧草生產(chǎn)的季節(jié)性與家畜對(duì)營養(yǎng)需求的相對(duì)均勻性之間存在的供求矛盾[7]。前期試驗(yàn)得到飼料油菜的不同生育時(shí)期營養(yǎng)成份，見表1。本試驗(yàn)在前期試驗(yàn)基礎(chǔ)上，研究不同生育期飼料油菜的體外發(fā)酵特性，旨在為生產(chǎn)中飼料油菜合理的利用提供參考數(shù)據(jù)。

表1 不同生育期的飼料油菜常規(guī)營養(yǎng)成分（%，絕干基礎(chǔ)）

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)基地情況

本試驗(yàn)的種子由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，為“華油雜62”。種植地位于黑龍江省海倫市（45°58′～47°52′N，126°14′～127°45′E），最高氣溫達(dá)37.7 ℃，最低氣溫達(dá)-40.3 ℃，平均氣溫在2 ℃左右。年均降水量為500～600 mm，主要集中在5～9月份。無霜期在120 d左右，終霜期多在5月中下旬開始。年日照達(dá)2 600～2 800 h。

1.2 試驗(yàn)樣品準(zhǔn)備

飼料油菜分別在現(xiàn)蕾期、盛花期和結(jié)莢期進(jìn)行采集，保證全株距離地面3 cm 刈割。在保證飼料油菜全株的情況下，每個(gè)生育期樣品分別隨機(jī)選取3 個(gè)代表性樣方。樣品在105 ℃、15 min 的烘箱內(nèi)進(jìn)行殺青處理，接著進(jìn)行風(fēng)干樣制備，條件控制在65 ℃、48 h。最后樣品進(jìn)行粉碎過1 mm 篩，密封袋保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物條件

試驗(yàn)選用3 頭體重在(500±50)kg 的中國荷斯坦奶牛，年齡在3.5 歲并裝有永久性瘤胃瘺管。在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)阿城試驗(yàn)基地（45°31′N、127°02′E）實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行體外發(fā)酵試驗(yàn)。試驗(yàn)牛飼養(yǎng)按1.3 倍維持水平，日糧精粗比為45∶55。日糧主要成分見表2。保證自由飲水，早6:00和晚18:00飼喂。

1.4 瘤胃液采集

瘤胃液采集工作在早6：00 飼喂結(jié)束后開始，保證采集是在瘤胃內(nèi)的5個(gè)不同位點(diǎn)，并將采集到的瘤胃液迅速裝入保溫瓶?jī)?nèi)，蓋好瓶蓋備用。保溫瓶應(yīng)事先39 ℃預(yù)熱并通入二氧化碳（C02）置換出瓶?jī)?nèi)的空氣。最后將采集到的瘤胃液充分混合后經(jīng)4 層紗布過濾處理。

表2 基礎(chǔ)日糧配方及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.5 體外發(fā)酵液的配制

1.5.1 緩沖液的配制

體外發(fā)酵的培養(yǎng)基按照Menke 等[8]的方法配制，緩沖液需要微量元素A 液、緩沖液B 液、常量元素C液、刃天青溶液D液、還原劑溶液E液，各溶液配方如表3所示。

表3 緩沖液各溶液的配方

1.5.2 人工瘤胃微生物營養(yǎng)培養(yǎng)液的配制

人工瘤胃微生物營養(yǎng)培養(yǎng)液需現(xiàn)用現(xiàn)配，按照下列比例和順序配制人工瘤胃微生物營養(yǎng)培養(yǎng)液：蒸餾水400 ml+A 液0.1 ml+B 液200 ml+C 液200 ml+刃天青溶液1 ml+還原劑溶液40 ml。當(dāng)加入刃天青溶液后混合液變?yōu)榧t色，馬上將配制好的培養(yǎng)液里通入CO2氣體并預(yù)熱至39 ℃，持續(xù)時(shí)間約30 min 后，培養(yǎng)液顏色變淡至無色。

1.5.3 混合培養(yǎng)液的配制

將過濾處理的瘤胃液和人工瘤胃微生物營養(yǎng)培養(yǎng)液按1∶2的比例混合，配制足量的混合培養(yǎng)液，此混合培養(yǎng)液接近瘤胃內(nèi)發(fā)酵環(huán)境。

1.6 試驗(yàn)發(fā)生配制和體外發(fā)酵裝置

由恒溫水浴搖床和培養(yǎng)單位裝置構(gòu)成體外發(fā)酵裝置。恒溫水浴搖床的工作條件為39 ℃；培養(yǎng)單位是帶有100 ml刻度的玻璃注射器，并在注射器活塞管上涂抹少量石蠟的方法，來防止漏氣和減少阻力。

本試驗(yàn)選用現(xiàn)蕾期、盛花期和結(jié)莢期的飼料油菜為3個(gè)試驗(yàn)樣，在每個(gè)注射器內(nèi)分別放入200 mg試驗(yàn)樣，并用注射器準(zhǔn)確吸取30 ml 的混合培養(yǎng)液。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組作為氣體校正。將封閉好的發(fā)酵注射器全部轉(zhuǎn)入39 ℃恒溫?fù)u床進(jìn)行體外發(fā)酵。

1.7 測(cè)定指標(biāo)和方法

分別在2、4、8、12、24、36、48 h 和72 h 進(jìn)行產(chǎn)氣量的測(cè)定；在4、12、24、48 h和72 h后取出各組發(fā)酵培養(yǎng)液，冷凍保存用于測(cè)定NH3-N 含量和VFA 的各組分含量。其中產(chǎn)氣量由刻度注射器直接讀出。產(chǎn)氣量利用SAS9.1 程序，根據(jù)?rskov 和McDonald 的產(chǎn)氣模型公式將各組樣品在2、4、8、12、24、36、48 h和72 h時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量代入，計(jì)算消化動(dòng)力參數(shù)。NH3-N通過標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制來測(cè)定。VFA通過氣象色譜測(cè)定。

1.8 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2003 整理數(shù)據(jù)和結(jié)果換算。用SAS9.1版軟件進(jìn)行方差統(tǒng)計(jì)分析，均值多重比較采用Duncan's法，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生育期飼料油菜對(duì)體外發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響

如表4 所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，不同生育期飼料油菜體外發(fā)酵累計(jì)產(chǎn)氣量呈遞增趨勢(shì)；培養(yǎng)48 h以前的階段，氣體增加較快，之后產(chǎn)氣量變化較平緩，但結(jié)莢期在最后的48～72 h產(chǎn)氣量增加波動(dòng)較大。其中現(xiàn)蕾期和盛花期在整個(gè)發(fā)酵過程中產(chǎn)氣曲線趨勢(shì)基本吻合。72 h 的累計(jì)產(chǎn)氣量表現(xiàn)為現(xiàn)蕾期顯著高于盛花期和結(jié)莢期（P＜0.05），盛花期高于結(jié)莢期，但差異不顯著（P＞0.05）。隨著飼料油菜生育期的增長(zhǎng)，理論最大產(chǎn)氣量有遞減的趨勢(shì)，但各組之間差異不顯著（P＞0.05），這與李富娟等[9]研究結(jié)果一致。產(chǎn)氣速度有隨著生育期的增長(zhǎng)而增大的趨勢(shì)（P＞0.05）。結(jié)莢期的產(chǎn)氣延滯期顯著低于盛花期（P＞0.05）和現(xiàn)蕾期（P＜0.05）。

表4 不同生育期飼料油菜對(duì)體外產(chǎn)氣量及產(chǎn)氣參數(shù)的影響

2.2 不同生育期飼料油菜對(duì)體外發(fā)酵NH3-N含量的影響

表5 不同生育期飼料油菜體外培養(yǎng)對(duì)NH3-N含量影響(mg/dl)

由表5可知，各組培養(yǎng)液NH3-N濃度隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加。在12～48 h 內(nèi)，各生育期體外發(fā)酵產(chǎn)生的NH3-N增加顯著，其中盛花期NH3-N濃度最高。在培養(yǎng)24 h時(shí)，NH3-N濃度由高到低依次是盛花期、現(xiàn)蕾期、結(jié)莢期（P＜0.05）。48 h以后，NH3-N 濃度增加緩慢。在72 h 時(shí)盛花期NH3-N 濃度顯著高于結(jié)莢期（P＜0.05），高出3.25 mg/dl。

2.3 不同生育期飼料油菜對(duì)體外發(fā)酵VFA 含量的影響

如表6 所示，體外培養(yǎng)72 h 后，不同生育期的各VFA 含量變化規(guī)律相似，在4～12 h 呈升高趨勢(shì)，12～24 h有所下降，24 h～48 h逐漸回升。在4 h時(shí)間點(diǎn)，現(xiàn)蕾期的乙酸濃度顯著高于盛花期（P＞0.05）和結(jié)莢期（P＜0.05），但盛花期和結(jié)莢期差異不顯著（P＞0.05），12 h以后，不同生育期的乙酸濃度差異不顯著（P＞0.05）；在12、24 h和72 h時(shí)間點(diǎn)，盛花期丙酸和丁酸濃度最低，但差異不顯著（P＞0.05）；乙酸與丙酸比值的結(jié)果表明，4 h時(shí)間點(diǎn)現(xiàn)蕾期顯高于結(jié)莢期（P＜0.05），但不顯著高于盛花期（P＞0.05），在72 h時(shí)間點(diǎn)，盛花期顯高于結(jié)莢期（P＜0.05），但不顯著高于現(xiàn)蕾期（P＞0.05）。

表6 不同生育期飼料油菜對(duì)瘤胃體外發(fā)酵VFA含量的影響

3 討論

3.1 不同生育期飼料油菜對(duì)體外發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響

在一定時(shí)間內(nèi)，體外發(fā)酵累計(jì)產(chǎn)氣量的多少可以反映出發(fā)酵底物中碳水化合物被瘤胃微生物利用的程度，同時(shí)發(fā)酵底物營養(yǎng)價(jià)值的高低也影響產(chǎn)氣量。目前預(yù)測(cè)干物質(zhì)降解率的最主要指標(biāo)是體外發(fā)酵產(chǎn)氣方法[10]。Clark 等[11]指出有機(jī)物含量越多會(huì)影響瘤胃內(nèi)微生物活性，從而使產(chǎn)氣量多，換言之，飼糧中可發(fā)酵的有機(jī)物含量和產(chǎn)氣量之間存在正相關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著飼料油菜生育期的延長(zhǎng)，其體外發(fā)酵產(chǎn)氣量逐漸下降，這可能是植物的次生細(xì)胞壁中不易降解的纖維素和木質(zhì)素多的原因。隨著植物的生長(zhǎng)越來越成熟，植物細(xì)胞壁成分會(huì)由易溶性的初生細(xì)胞壁成分轉(zhuǎn)化為不易溶的成熟次生細(xì)胞壁[12]。飼料油菜的結(jié)莢期含有較高的中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和木質(zhì)素。試驗(yàn)結(jié)果可以看出體外發(fā)酵累計(jì)總產(chǎn)氣量與CP 含量呈正相關(guān)，與ADF、NDF 含量呈負(fù)相關(guān)。這與湯少勛等[13]和Nsahlai等[14]研究結(jié)果一致。

3.2 不同生育期飼料油菜對(duì)體外發(fā)酵NH3-N含量的影響

瘤胃的氮代謝受瘤胃液中NH3-N 濃度的影響，NH3-N 濃度主要受來自瘤胃微生物對(duì)氮利用速度和飼料含氮物質(zhì)在瘤胃降解速率間動(dòng)態(tài)平衡的影響，NH3-N 濃度的高低可反映出瘤胃微生物生成菌體蛋白和飼料日糧中蛋白質(zhì)降解的情況[15]，在特定日糧組成模式下，NH3-N濃度一定程度上反映了蛋白質(zhì)合成與分解間達(dá)到的平衡狀態(tài)[16]。體外發(fā)酵底物中蛋白質(zhì)的含量、理化特性和降解速率以及發(fā)酵底物含氮物和能量載體物的比例等都會(huì)影響體外發(fā)酵體系中NH3-N濃度，特別是微生物菌體蛋白的合成速率與微生物降解的影響[17]。在一般情況下，都會(huì)產(chǎn)生氮的損失和飼料蛋白質(zhì)的浪費(fèi)，因?yàn)榘钡漠a(chǎn)生速率遠(yuǎn)超過微生物對(duì)他的利用的速率，過量的氨以尿素形式排出體外。本試驗(yàn)NH3-N 濃度在瘤胃微生物生長(zhǎng)所需最佳NH3-N 濃度5～28 mg/dl[18]的范圍內(nèi)。試驗(yàn)表明，NH3-N濃度隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各生育期飼料油菜的累計(jì)NH3-N 產(chǎn)量逐漸提高，在48 h 以后，NH3-N 產(chǎn)生速率開始降低，這與程茂基[19]研究結(jié)果一致。由于體外發(fā)酵底物只有牧草，能量供應(yīng)不足，瘤胃內(nèi)微生物在利用氨合成蛋白質(zhì)的過程無法獲得充足能量，導(dǎo)致NH3-N 的積累增加[20]。72 h NH3-N 濃度表現(xiàn)為盛花期顯著高于現(xiàn)蕾期和結(jié)莢期（P＜0.05）。隨著生育期的增長(zhǎng)，NH3-N 呈降低趨勢(shì)，與余苗[21]試驗(yàn)結(jié)果一致；整個(gè)過程，NH3-N 與CP 有正相關(guān)關(guān)系，與ADF 和NDF有負(fù)相關(guān)關(guān)系，這與Cone等[22]、甘潔[23]和余苗等[24]的研究結(jié)果相符。原因可能是，可利用粗蛋白的含量會(huì)隨著植物生育期的增長(zhǎng)而減少，相反細(xì)胞壁中的半纖維素、纖維素以及木質(zhì)素等不可利用部分含量增加，引起消化率下降。飼料蛋白的降解是瘤胃內(nèi)大部分NH3-N的直接來源，通過測(cè)定瘤胃內(nèi)NH3-N濃度可反映出牧草中蛋白的瘤胃降解特性。NH3-N濃度高低，可以得出蛋白質(zhì)降解的多少，因此NH3-N濃度含量是評(píng)價(jià)飼料品質(zhì)的主要指標(biāo)之一。本試驗(yàn)結(jié)果可以看出結(jié)莢期飼料油菜沒有現(xiàn)蕾期和盛花期飼料油菜理想。

3.3 不同生育期飼料油菜對(duì)體外發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸含量的影響

揮發(fā)性脂肪酸（VFA）是能量代謝的主要能量來源，反芻動(dòng)物瘤胃中的碳水化合物經(jīng)微生物作用發(fā)酵所產(chǎn)生的VFA 主要包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸等，其中前三種酸占能源物質(zhì)的80%。反芻動(dòng)物乳脂合成的主要前體物質(zhì)是乙酸[25]，葡萄糖合成的主要底物是丙酸，乙酸/丙酸可以間接反映能量利用率的情況。飼草中的不可利用部分，比如半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的含量，會(huì)影響瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生乙酸的含量[21]，而纖維素的降解率對(duì)乙酸含量的影響更大[26]。本降解試驗(yàn)得出盛花期的NDF有效降解率和NDF快速降解部分大于其他時(shí)期，所以72 h發(fā)酵試驗(yàn)得出盛花期的乙酸濃度最高（P＞0.05）。乙酸/丙酸的值在3以下屬于丙酸型發(fā)酵，而在3 以上為乙酸型發(fā)酵。本試驗(yàn)不同生育期的各時(shí)間點(diǎn)乙酸比丙酸的值都大于3。結(jié)果說明，飼料油菜的不同生育期發(fā)酵類型均趨于乙酸類型。Slianikove 等[27]研究表明單寧可抑制微生物活性，試驗(yàn)發(fā)酵72 h以后，盛花期的乙酸/丙酸比值顯著高于結(jié)莢期（P＜0.05），可能是盛花期飼料油菜單寧含量較低的原因，對(duì)瘤胃微生物的某些菌群的抑制作用較弱，這與李占明等[28]和馬敏等[29]研究規(guī)律一致。Wang 等[30]和Ngamsaeng 等[31]研究表明單寧含量對(duì)乙酸/丙酸存在影響。

4 結(jié)論

隨著體外發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，最大產(chǎn)氣量逐漸降低，表現(xiàn)出現(xiàn)蕾期最高，結(jié)莢期最低；發(fā)酵72 h，盛花期的NH3-N濃度、乙酸濃度和乙酸/丙酸濃度最高，結(jié)莢期最低。盛花期的飼料油菜發(fā)酵效果較好。