朱葉，申雨珂，JOTHAME Mupunga，吳元鋒，，毛建衛(wèi)

（1.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310023；2.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心（2011協(xié)同創(chuàng)新中心），浙江 杭州 310023）

西蘭花又名花椰菜、青花菜，含有硫代葡萄糖苷（glucosinolate，GSL）和內(nèi)源性黑芥子酶等成分。在收割、切碎、咀嚼等過(guò)程中，GSL 可被黑芥子酶水解生成異硫氰酸酯（isothiocyanates，ITCs），其主要的水解產(chǎn)物有蘿卜硫素（sulforaphane，SF）、芥酸（1-isothiocyanato-4-methylsulfanylbutane，ERN）、1-丁烯基-4-異硫氰酸酯（1-butene-4-isothiocyanate，BITC）等[1-2]。SF 能有效抑制前列腺癌、肝癌、直腸癌等癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖[3-5]，此外SF 還具有預(yù)防Ⅱ型糖尿病、神經(jīng)障礙、非酒精性脂肪肝等作用[6-8]。SF 具有上述功能主要是這種活性物能抑制I 型酶，刺激人體或動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)機(jī)體有益的細(xì)胞醌氧化還原酶（quinone oxidoreductase，NQO1）等Ⅱ型酶，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子NF-E2 相關(guān)因子（nuclear factor erythroid2-related factor 2，Nrf2），抑制轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor-κB，NF-κB）活性等功能[9-10]。其他的異硫氰酸酯，如ERN、苯乙基異硫氰酸酯（phenethyl isothiocyanate，PITC）、烯丙基異硫氰酸酯（allyl isothiocyanate，AITC）等也具有類(lèi)似的活性[11-12]。

雖然SF 等物質(zhì)具有上述活性，但是在烹飪后的蔬菜中含量較低，主要是由于黑芥子酶易失活。研究表明，不管用何種烹飪方法，都會(huì)降低黑芥子酶的活性[13-14]。作者研究表明，西蘭花在微波加熱4.8 min 后黑芥子酶即完全失去活性[15]。清炒是我國(guó)最常用的西蘭花烹飪方法，經(jīng)過(guò)清炒，西蘭花的黑芥子酶也會(huì)失去活性，從而降低西蘭花的ITCs 含量與營(yíng)養(yǎng)學(xué)功效。本論文的主要目的是研究清炒方式對(duì)西蘭花中SF 等ITCs 含量的影響，以期提高蔬菜中ITCs 的含量，以及研究不同清炒方式對(duì)西蘭花提取物抑制小鼠黑色素瘤B16 細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)B16 細(xì)胞NQO1 活性等方面的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西蘭花：當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；純SF（純度＞98%）、煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP+）（純度＞98%）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（純度＞98%）、甲萘醌（純度＞98%）、雙香豆素（純度＞98%）、葡萄糖-6-磷酸（純度＞98%）、黃素腺嘌呤（flavin adenine，F(xiàn)AD）（純度＞98%）（以上試劑均為分析純）：美國(guó)sigma 公司；牛血清白蛋白、噻唑藍(lán)、1，4-苯二硫醇（純度＞95%）、1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒：上海生工生物工程公司；B16細(xì)胞：上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax M3 酶標(biāo)儀：美國(guó)分子儀器公司；RE-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；EXF24086V超低溫冰箱、PICO 高速離心機(jī)、BB150 CO2培養(yǎng)箱：美國(guó) Thermo Fisher Scientific；A6-6BC 手持式高速勻漿機(jī)：上海毆和機(jī)械設(shè)備有限公司；G1701EA 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司；e2695 HPLC高效液相色譜儀：美國(guó)沃特世科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 西蘭花異硫氰酸酯等成分的酶解和提取

根據(jù)清炒條件，分為3 組：新鮮西蘭花（RB）、直接炒西蘭花（DS）以及先酶解后炒西蘭花（HS）。RB 組：100 g 新鮮西蘭花花蕾切碎，加入170 mL 的磷酸緩沖液和330 mL 的二氯甲烷，攪拌浸提2 h，真空抽濾，濾液分層后收集有機(jī)相，殘?jiān)退嘣儆枚燃淄槌樘? 次，合并有機(jī)相，加入無(wú)水硫酸鈉去除有機(jī)相的水分，旋轉(zhuǎn)蒸干，25 mL 甲醇定容，保存?zhèn)溆?。DS 組：電磁爐功率為1 200 W，預(yù)熱1 min，100 g 西蘭花花蕾切碎，立即倒入并充分翻炒4 min，立即置于冰水浴冷卻，后續(xù)的提取步驟與RB 組相同；HS 組：100 g 西蘭花切碎，放于37 ℃保溫1 h，后續(xù)的清炒、提取步驟與DS 組相同。每組試驗(yàn)均重復(fù)3 次。將所得樣品放于4 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.3.2 總異硫氰酸酯含量測(cè)定

ITCs 總量按照文獻(xiàn)[16]環(huán)縮合法分析，并稍作改進(jìn)。樣品與20 mmol/L 磷酸鉀緩沖液（pH8.5）、10 mmol/L 1，4-苯二硫醇混勻，65 ℃保溫2 h。反應(yīng)結(jié)束后冷卻到室溫 25 ℃，再經(jīng) 12 000 r/min 10 min，上清液經(jīng) 0.22 μm微濾膜過(guò)濾。液相分析條件：流動(dòng)性為80%甲醇、20%水，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng) 365 nm。色譜柱為 4.6×250 mm i.d.，5 μm WondaCract ODS-2柱。以 1.25 μmol/L～10 μmol/L 濃度的蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 氣質(zhì)聯(lián)用分析異硫氰酸酯

西蘭花水解產(chǎn)物的成分和含量通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometer，GCMS）7890A GC 氣質(zhì)聯(lián)用儀分析[17]。色譜柱為Hp-5MS的 UI 毛細(xì)管柱（0.25 μm，30 m×0.25 i.d.），進(jìn)樣量為1 μL，氣化室溫度為300 ℃。柱程序升溫：50 ℃維持2 min，以 10 ℃/min 升至 190 ℃，再以 20 ℃/min 升至300 ℃，維持5 min。載氣為超高純氦，分流比為10 ∶1。質(zhì)譜條件：接口溫度220 ℃，電離方式為EI，電離能量為70 eV，質(zhì)量范圍為35 到500 amu。以環(huán)己酮為內(nèi)標(biāo)物。

1.3.4 噻唑藍(lán)（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）法分別檢測(cè)SF 和西蘭花提取物對(duì)小鼠B16 細(xì)胞的抑制作用

SF 及西蘭花提取物對(duì)小鼠B16 細(xì)胞的抑制作用采用噻唑藍(lán)MTT 法檢測(cè)[18]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16 細(xì)胞，用含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶溶液進(jìn)行消化，制備成單細(xì)胞懸液，接種于 96 孔板中，每孔 100 μL，1×104個(gè)細(xì)胞/孔，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁，加入含有不同SF 濃度的培養(yǎng)液，使SF 最終濃度分別為 2.5、5、10、20、30 和 40 μmol/L，每個(gè)濃度設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔；各組西蘭花提取物稀釋相同的倍數(shù)，使RB 組中ITCs 總濃度為20 μmol/L。另設(shè)兩組對(duì)照組，空白對(duì)照組僅含有培養(yǎng)液，正常對(duì)照組含有不同SF 濃度的小鼠B16 細(xì)胞，多余的孔內(nèi)加入無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）。將加入藥物的細(xì)胞放置37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h 后，在每個(gè)試驗(yàn)孔中加入20 μL 濃度為5 mg/mL 的無(wú)菌MTT 溶液，繼續(xù)孵育4 h，將試驗(yàn)孔中的培養(yǎng)液吸去，每孔加入150 μL 的二甲基亞砜溶解孔中的甲瓚。將96 孔板置于搖床避光振蕩混勻10 min，檢測(cè)570 nm處各孔的OD 值，計(jì)算不同濃度的SF 作用B16 細(xì)胞24 h 后的抑制率。每個(gè)試驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.3.5 SF 或西蘭花提取物對(duì)B16 細(xì)胞中NQO1 活性的影響

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的小鼠B16 細(xì)胞接種于6 孔板，每孔 2 mL，5×105個(gè)/孔。待細(xì)胞貼壁后，加入 SF 和稀釋倍數(shù)相同的西蘭花提取物，使RB 組西蘭花提取物中 ITCs 的含量為 20 μmol/L。6 孔板放入 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，去除每孔中舊的培養(yǎng)液，用無(wú)菌PBS洗3 次，加入含乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）的胰蛋白酶消化液消化。細(xì)胞懸液1 000 r/min 離心5 min，沉淀加入細(xì)胞裂解液、二硫蘇糖醇、蛋白酶抑制劑體積比為200 ∶1 ∶2，用手持高速勻漿機(jī)高速剪切2 min，冰敷10 min，重復(fù)3 次，再于10 000 r/min 下離心 30 min，取上清液，分裝于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

NQO1 的活性按照文獻(xiàn)方法[19]測(cè)定。配制混合液（25 mmol/L Tris-HCl 緩沖液，0.67 mg/mL 牛血清白蛋白，0.01% 吐溫-20，0.02 mmol/LNADP+，1 mmol/L 葡萄糖-6-磷酸，5 μmol/L 腺嘌呤黃素，2U 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，0.72 mmol/L MTT 和 50 μmol/L 甲萘醌），混合液與樣品溶液按照體積比4 ∶1 混合?；旌虾笤?10 nm下每隔1 min 測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定5 min，最后加入25 μL 0.3 mmol/L 雙香豆素終止反應(yīng)，每隔1 min測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定5 次，以斜率計(jì)算MTT 的還原量。樣品的蛋白含量通過(guò)蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定，以牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。NQO1 酶活性以（nmol 還原MTT/min/mg蛋白）表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同清炒方式對(duì)西蘭花中各ITCs含量的影響

通過(guò)氣質(zhì)聯(lián)用分析不同清炒方式對(duì)西蘭花中各ITCs 含量的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。

結(jié)果表明提取物中主要含有SF、ERN、BITC，其中SF 的含量最高，其次是BITC，ERN 的含量最低。RB組和 HS 組中總 ITCs、SF、ERN、BITC 含量明顯高于DS 組，RB 組中 ITCs 含量為（36.22±12.01）mg/100 mg，其中 SF、ERN、BITC 的含量分別為 （14.96±4.21）、（0.60±0.01）、（9.16±3.15）mg/100 mg；DS 組中 ITCs 含量為（10.64±2.41）mg/100 mg，SF、ERN、BITC 的含量分別為 （4.2±0.7）、0、（2.45±0.33）mg/100 mg；HS 組中ITCs 含量為（30.90±10.88）mg/100 mg，而 SF、ERN、BITC 的含量分別為（12.99±4.25）、（0.76±0.20）、（6.71±2.01）mg/100 mg。RB 組是新鮮西蘭花，其水解液中SF、BITC 含量最高；HS 組水解液中總 ITCs、SF、ERN含量也明顯高于DS 組，且RB 組和HS 組不存在顯著性差異（P ＞ 0.05），HS 組和 DS 組間存在顯著性差異（P ＜0.05），表明酶解后再清炒西蘭花的ITCs 含量與新鮮西蘭花相當(dāng)。

圖1 新鮮西蘭花（RB）、直接炒西蘭花（DS）和先酶解后炒西蘭花（HS）中總 ITCs（A）、SF（B）、ERN（C）和 BITC（D）組分的含量Fig.1 The contents of total ITCs（A），SF（B），ERN（C）and BITC（D）in raw broccoli（RB），direct stir-fried broccoli（DS），hydrolyzed and stir-fried broccoli（HS）.

2.2 純SF對(duì)B16細(xì)胞增殖的影響

以 MTT 法檢測(cè)濃度為 2.5、5、10、20、30、40 μmol/L的純SF 對(duì)B16 細(xì)胞抑制作用，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 SF 對(duì)B16 細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率Fig.2 Proliferative inhibition of SF on B16 cells

由圖2可知，B16 細(xì)胞的抑制率隨著SF 濃度的增加而逐漸增大。20、30 μmol/L 和 40 μmol/L 濃度的 SF對(duì) B16 細(xì)胞的抑制率分別為（39.72±1.66）%、（79.67±1.66）%和（96.92± 2.38）%，抑制效果較為顯著，5、10、20 μmol/L 的 SF 對(duì) B16 細(xì)胞的 24h 抑制率無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 西蘭花提取物對(duì)B16細(xì)胞增殖的影響

由 2.2 可知，20 μmol/L 的 SF 對(duì) B16 細(xì)胞有一定的抑制作用，因此將RB 組、HS 組和DS 組西蘭花提取物稀釋相同的倍數(shù)，使RB 組ITCs 的濃度為20 μmol/L，此時(shí)，HS 組 ITCs 的濃度為 17 μmol/L，DS組為6.57 μmol/L。將稀釋好的各組西蘭花提取物作用B16 細(xì)胞 24 h，并與 20 μmol/L 的純 SF 結(jié)果做比較。結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，各組提取物對(duì)B16 細(xì)胞的生長(zhǎng)都有一定的抑制作用，各組間不存在顯著性差異（P ＞0.05），但是與純SF 作用組相比均有顯著差異（P ＜0.05）。

2.4 西蘭花對(duì)B16細(xì)胞NQO1活性的影響

采用 20.00 μmol/L 的 SF 作用細(xì)胞，RB、DS 和 HS組也稀釋相同倍數(shù)，使RB 組西蘭花提取物中總ITCs濃度為 20.00 μmol/L，此時(shí) HS 組 ITCs 的濃度為17.00 μmol/L，DS 組為 6.57 μmol/L，并與空白對(duì)照做比較（不添加西蘭花提取液），結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖3 西蘭花提取物對(duì)B16 細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制Fig.3 Proliferative inhibition of broccoli extracts on B16 cells

圖4 西蘭花對(duì)B16 細(xì)胞NQO1 活性的影響Fig.4 Effects of broccoli extracts and SF on the NQO1 activity of B16 cells

由圖4可知，20.00 μmol/L 的 SF 顯著提高了NQO1的活性，對(duì)照組、SF、RB、DS、HS 各組細(xì)胞中的 NQO1的活性分別為（4.22±1.60）、（34.71± 4.03）、（19.53±3.59）、（12.58 ± 4.32）、（22.57 ± 3.56）（nmol 還原 MTT/min/mg 蛋白），其中SF 組與西蘭花組存在顯著性差異（P ＜ 0.05）；RB 組和 HS 組提取物對(duì) NQO1 活性的影響較為顯著，與 DS 組存在顯著性差異（P ＜ 0.05），但是RB 組和 HS 組之間不存在顯著性差異（P ＞ 0.05）。

3 討論

SF 等ITCs 是通過(guò)黑芥子酶水解GLS 得到的[20]，黑芥子酶在烹飪過(guò)程中易失活，因此烹飪西蘭花對(duì)ITCs 含量有很大的影響[15]。為了提高烹飪西蘭花ITCs的含量，許多學(xué)者提出了有效的方法，如Ghawi 等[21]在烹飪后的西蘭花中添加芥菜籽粉末，SF 的含量顯著提高。熟的西蘭花中添加蘿卜根粉末，也得出類(lèi)似的結(jié)論[22]。這是由于GLS 很穩(wěn)定，烹飪過(guò)程中不會(huì)分解，通過(guò)添加含有黑芥子酶的芥菜籽或蘿卜根粉末，可使GLS 酶解為ITCs。但這些方法的缺點(diǎn)是在西蘭花中添加芥菜籽或蘿卜根，可能會(huì)影響食物的口感。在本論文中，提出了一個(gè)新的方法，即把西蘭花切碎并保溫1 h，使GLS 被酶解為ITCs。ITCs 比黑芥子酶穩(wěn)定，因此烹飪后仍然有較高的ITCs 含量。經(jīng)過(guò)清炒后，盡管DS 組也有水解步驟，但此時(shí)內(nèi)源性黑芥子酶已經(jīng)失活，因此HS 組水解液中SF、ERN、BITC 等異硫氰酸酯的含量均比DS 高。Torres-Contreras 等[23]報(bào)道西蘭花切碎后，其ITCs 的含量提高了133 %，這是由于切碎過(guò)程中GLS 即發(fā)生了酶解，提高了ITCs 的含量。本論文中，HS 組增加了酶解時(shí)間，ITCs 含量是DS 組的2.6 倍。

較高的ITCs 含量意味著較好的活性，因此，本論文又分析了不同清炒方式的西蘭花提取物對(duì)B16 細(xì)胞抑制率和NQO1 活性的影響，并與純SF 的活性作比較。細(xì)胞抑制試驗(yàn)表明，與西蘭花提取物相比，20 μmol/L的SF 在B16 細(xì)胞的抑制率和提高NQO1 酶活方面具有更好的活性。這主要是由于本論文通過(guò)環(huán)縮合法測(cè)定西蘭花提取物中總ITCs 含量，如前所述，除了SF 外，西蘭花提取物中還含有ERN、BITC 等其他異硫氰酸酯，這些活性物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用比SF 弱。例如，文獻(xiàn)表明SF 和ERN 都可以提高A549 肺癌細(xì)胞的多抗藥性蛋白的表達(dá)，但是SF 的活性比ERN 要高[24]。在抑制銅綠假單胞菌等細(xì)菌的群體感應(yīng)方面，SF活性也比ERN 高[25]。根據(jù)已有的文獻(xiàn)報(bào)道，SF 活性是異硫氰酸酯中最強(qiáng)的[9]。因此，盡管RB 組西蘭花提取物ITCs 總量也是20 μmol/L，但是由于含有其它的異硫氰酸酯，因此細(xì)胞活性相對(duì)較低。

NQO1 是絕大多數(shù)真核生物細(xì)胞中普遍存在的一種黃素蛋白酶，能夠解除許多天然和合成化合物的毒性，同時(shí)又能活化一些醌類(lèi)抗腫瘤藥物[26]。許多天然活性物，如葡萄籽原花青素、生姜提取物、冬凌草甲素等能提高細(xì)胞或機(jī)體的NQO1 活性[27-29]。西蘭花提取物中的ITCs 也可以顯著提高膀胱細(xì)胞、HL-60 白血病細(xì)胞以及小鼠體內(nèi)膀胱組織或腸粘膜的NQO1 活性[19，30-31]。本論文的結(jié)果也表明，西蘭花提取物可顯著提高 B16 細(xì)胞中 NQO1 活性（P ＜ 0.05），因此經(jīng)常食用西蘭花有利于人體健康。通過(guò)先酶解再清炒，其ITCs含量和活性與新鮮西蘭花沒(méi)有顯著差異，因此該烹飪方法能有效維持西蘭花的功能成分和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，與直接清炒相比，先酶解再清炒可有效提高西蘭花中異硫氰酸酯含量，且能顯著提高 B16 細(xì)胞中 NQO1 的活性（P＜0.05）。但是不同清炒方式對(duì)抑制B16 細(xì)胞增殖活性沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。西蘭花先酶解再清炒，其ITCs 含量和誘導(dǎo)NQO1活性與新鮮西蘭花沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），與直接清炒的西蘭花相比存在顯著性的差異（P＜0.05），該烹飪方法能有效維持西蘭花的功能成分和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。