李雍，林峰，秦勇，劉偉，周雅琳，李?，B，于蘭蘭，許雅君，4，

（1.北京大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學系，北京 100191；2.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100029；3.正生營養(yǎng)研究院，新疆 昌吉 830000；4.食品安全毒理學研究與評價北京市重點實驗室，北京 100191）

近年來隨著我國酒類產(chǎn)量的不斷增加，飲酒率及酒精性肝病的發(fā)病率也在逐年增長[1]，而酒精的過量攝入及長期低劑量攝入對人類身體健康都有極大危害。酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）是指由于長期大量攝入酒精而導致肝臟損害的一系列病變[2]。該病主要由促進脂肪變性過程的酒精代謝副產(chǎn)物驅動，可導致脂肪性肝炎、纖維化、肝硬化、肝功能衰竭，甚至肝癌[3]?，F(xiàn)今，臨床上的很多治療肝損傷的藥物所帶來的毒副作用不容回避，而充分利用天然植物資源，開發(fā)具有保肝作用的植物資源，可以為新型保肝藥提供理論基礎。

我國玉米資源豐富，生產(chǎn)淀粉一直以來都是其最大的商業(yè)開發(fā)途徑，而生產(chǎn)所得副產(chǎn)物——玉米麩質粉中醇溶蛋白的高憎水性，限制了它在食品中的廣泛應用[4]，而將玉米蛋白水解制成的玉米肽當前已被證明有著抗氧化、醒酒、降低血清中膽固醇濃度等多種保健食品的優(yōu)良特性，本研究采用新疆地區(qū)特有的粉質型玉米品種，立足于該地區(qū)特色植物多肽的功效研究，著力為開發(fā)其特色玉米品種的保健應用提供新思路，為該拓寬地區(qū)特色玉米的商業(yè)用途提供理論基礎的同時，也為保肝護肝藥資源的開發(fā)提供了優(yōu)質的天然植物資源，拉動了新疆地區(qū)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展并促進該地區(qū)維穩(wěn)工作的進行。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米肽以玉米黃粉為加工原料，經(jīng)蛋白分離純化、酶解、純化、干燥等步驟獲得。其相對分子質量＜1 000 D，由2～6 個氨基酸構成，可不經(jīng)消化，直接吸收供組織利用。凝膠色譜圖見圖1。

圖1 玉米肽凝膠色譜圖Fig.1 Corn peptide gel chromatogram

酪蛋白（Sigma C5890）：Sigma 公司。

健康成年SPF 級ICR 雄性小鼠50 只，使用許可證號：SCXX（京）2016-0010，體質量（25.0±5.0）g；受試動物由北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部提供，動物飼喂于屏障環(huán)境中。環(huán)境溫度為（23±2）℃，濕度50%～60%，明暗交替 12 h ∶12 h。

谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測試盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）測試盒、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）測試盒、蛋白質羰基（protein carbonyl，PC）測試盒、蛋白定量測試盒：南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

AR1140 電子分析天平：奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司；FLUO star Omega 多功能酶標儀：BMG LABTECH Inc.；BFX5-320 型低溫自動平衡離心機：白洋離心機廠；Allegra X-30R 臺式高速冷凍離心機：BECKMAN COULTERTM；HH·S11-1 電熱恒溫水浴鍋：北京長安科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 動物分組

50 只雄性ICR 小鼠經(jīng)1 周適應期后，稱重并按體重隨機分為5 組，分別為空白組、模型組、玉米肽低、中和高劑量組，每組各10 只。各組均給予維持飼料，自由進食、飲用無菌去離子水。

1.3.2 造模及給藥

實驗期間每天早上 8：00～10：00 對小鼠灌胃，對各劑量組灌胃給藥不同劑量受試樣品，其中低劑量組：0.4 g（/kg·bw）、中劑量組：0.8 g（/kg·bw）、高劑量組：1.6 g（/kg·bw），對照組和模型組給予等體積的酪蛋白1.6 g（/kg·bw），以灌胃容量0.1 mL/10 g 連續(xù)灌胃30 d，并根據(jù)體質量來調整灌胃劑量，灌胃期間自由取食和飲水。實驗時間30 d。間隔5 d 稱重并記錄其體重與攝食量。末次灌胃后除對照組外，其他4 組禁食16 h，然后一次性經(jīng)口灌胃給予50%乙醇12 mL（/kg·bw）。

1.3.3 測試樣品制備及指標檢測

模型對照組和實驗組灌胃乙醇6 h 后，摘眼球取血處死，血液分全血和血清兩部分進行收集，其中一部分采用0.5 mL 離心管收集，3 000 r/min 離心10 min，取上清液備用（用于檢測血液T-SOD 和丙二醛含量），另一部分用1.5 mL 抗凝管收集全血備用（用于檢測血液 GSH-Px 和 GSH 含量）。

解剖小鼠取肝臟并準確稱取4 份0.1 g 的肝臟組織，其中3 份加入9 倍體積的生理鹽水（用于測肝臟GSH、T-SOD、GSH-Px、MDA），另外一份加入蛋白質羰基含量測試盒試劑一（用于測肝臟蛋白質羰基含量），制成10%的組織勻漿液后，2 500 r/min 離心10 min，取上清液備用。最后對小鼠的肝組織及血液中的指標采用測試盒說明書要求進行統(tǒng)一測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本實驗結果均為連續(xù)變量，以均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示。所有數(shù)據(jù)使用SPSS22.0 軟件進行統(tǒng)計分析。組間差異利用單因素方差分析（one-way ANOVA）處理，以p ＜0.05 作為具有統(tǒng)計學意義的差異判斷標準。采用最小顯著差數(shù)法（least significant difference，LSD）在方差齊時進行兩兩比較；采用Tamhane’s 法在方差不齊時進行比較。

2 結果與分析

2.1 玉米肽對小鼠體重及食物利用率的影響

實驗動物體重在實驗開始時均無顯著性差異（p＞0.05）。其體重及食物利用率在各組的變化結果見圖2和圖3。

圖2 玉米肽對小鼠體重的影響Fig.2 The effect of corn peptide on the weight of mice

圖3 玉米肽對小鼠食物利用率的影響Fig.3 Effect of corn peptide on the utilization rate of food in mice

由圖2、圖3可得，小鼠的體重隨著時間的延長而增長，各組的食物利用率及凈增體重無顯著性差異（p＞0.05），各組動物在實驗過程中無表現(xiàn)異常，這說明玉米肽在實驗劑量范圍內對小鼠正常生長無影響，玉米肽對動物的生長發(fā)育無不良影響。

2.2 玉米肽對小鼠抗氧化物質GSH含量的影響

小鼠體內全血和肝臟抗氧化物質GSH 含量結果如表1所示。

表1 玉米肽對小鼠抗氧化物質GSH 的影響（±SD，n=10）Table 1 The effect of corn peptide on mice in whole blood and liver tissue GSH（±SD，n=10）

表1 玉米肽對小鼠抗氧化物質GSH 的影響（±SD，n=10）Table 1 The effect of corn peptide on mice in whole blood and liver tissue GSH（±SD，n=10）

注：#、*表示較之正常對照組/模型對照組p＜0.05，差異顯著；**表示較之正常對照組/模型對照組p＜0.01，差異極顯著。

組別全血/（g/L）肝臟/（mg/gprot）空白對照組 0.23±0.04 1.42±0.35模型對照組 0.19±0.04# 0.71±0.07#玉米肽低劑量組 0.23±0.04* 0.77±0.08玉米肽中劑量組 0.23±0.04* 1.00±0.24*玉米肽高劑量組 0.22±0.025** 1.25±0.23

模型組全血和肝臟中GSH 的含量顯著低于空白對照組（p＜0.05）；全血中的GSH 含量在各劑量組中均較之模型組顯著提升（p＜0.05），同時中劑量組肝組織的GSH 含量較之模型組也表現(xiàn)出了顯著上升（p＜0.05）。

2.3 玉米肽對小鼠抗氧化酶SOD活力的影響

小鼠血清和肝組織SOD 含量見表2。

表2 玉米肽對小鼠抗氧化酶SOD 活力的影響（±SD，n=10）Table 2 Effect of corn peptide on mice in serum and liver tissue SOD（±SD，n=10）

表2 玉米肽對小鼠抗氧化酶SOD 活力的影響（±SD，n=10）Table 2 Effect of corn peptide on mice in serum and liver tissue SOD（±SD，n=10）

注：#、*表示較之正常對照組/模型對照組p＜0.05，差異顯著；##、**表示較之正常對照組/模型對照組p＜0.01，差異極顯著。

組別血清/（U/mL）肝臟/（U/mgprot）空白對照組 104.32±7.11 248.50±24.57模型對照組 95.52±5.38# 202.80±13.84##玉米肽低劑量組 101.72±2.96 217.40±17.19##玉米肽中劑量組 103.40±4.00* 220.00±11.96##*玉米肽高劑量組 98.97±7.35 231.61±20.56#**

模型組較之空白對照組血清和肝組織中的SOD活性顯著降低（p＜0.05）；而各劑量組與模型組比較，中劑量組在血清SOD 酶活性有顯著提升（p＜0.05），肝臟中SOD 酶活性的顯著提升也在中、高劑量組有所體現(xiàn)（p＜0.05）。

2.4 玉米肽對小鼠抗氧化酶GSH-Px活力的影響

小鼠全血和肝組織中GSH-Px 酶含量結果見表3。

表3 玉米肽對小鼠抗氧化酶GSH-Px 活力的影響（±SD，n=10）Table 3 Effect of corn peptide on mice in whole blood and liver tissue GSH-Px（±SD，n=10）

表3 玉米肽對小鼠抗氧化酶GSH-Px 活力的影響（±SD，n=10）Table 3 Effect of corn peptide on mice in whole blood and liver tissue GSH-Px（±SD，n=10）

注：#、*表示較之正常對照組/模型對照組p＜0.05，差異顯著；##、**表示較之正常對照組/模型對照組p＜0.01，差異極顯著。

肝臟/（U/mgprot）空白對照組 573.70±43.53 584.68±35.13模型對照組 444.65±46.41## 420.32±25.81##玉米肽低劑量組 526.04±38.41#** 461.87±56.52##玉米肽中劑量組 607.74±28.88** 467.40±66.09##*玉米肽高劑量組 594.39±48.61** 563.16±67.10**組別 全血/（U/mL）

較之正常對照組，模型對照組全血和肝組織中的GSH-Px 活性顯著降低（p＜0.01）；全血中各劑量組提升GSH-Px 酶活性效果顯著（p＜0.01），而肝臟中玉米肽中、高劑量組也表現(xiàn)出了顯著的差異（p＜0.05）。

2.5 玉米肽對小鼠過氧化脂質降解產(chǎn)物MDA含量的影響

小鼠血清和肝臟組織中的MDA 含量結果見表4。

模型組肝組織中MDA 含量較之空白對照組提升顯著（p＜0.01）。高劑量組血清MDA 含量顯著低于模型組（p＜0.05），而肝臟中雖然各劑量組相對于模型組MDA 含量均有減少趨勢，但無顯著差異（p＞0.05）。

表4 玉米肽對小鼠脂質過氧化物MDA 含量的影響（±SD，n=10）Table 4 Effect of corn peptide on mice in serum and liver tissue MDA（±SD，n=10）

表4 玉米肽對小鼠脂質過氧化物MDA 含量的影響（±SD，n=10）Table 4 Effect of corn peptide on mice in serum and liver tissue MDA（±SD，n=10）

注：*表示較之模型對照組p＜0.05，差異顯著；##表示較之正常對照組p＜0.01，差異極顯著。

組別血清/（nmol/mL）肝臟/（nmol/mgprot）空白對照組 5.05±2.55 2.57±0.56模型對照組 6.68±2.00 6.40±0.64##玉米肽低劑量組 5.95±2.49 6.35±1.47##玉米肽中劑量組 5.19±2.02 6.00±1.69##玉米肽高劑量組 4.40±0.99* 5.59±0.83##

2.6 玉米肽對小鼠肝臟中PC含量的影響

機體PC 含量可以間接說明玉米肽抗氧化損傷的能力，結果見表5。

表5 玉米肽對小鼠肝臟蛋白質羰基含量的影響（±SD，n=10）Table 5 Effect of corn peptide on mice in liver tissue protein carbonyl（±SD，n=10）

表5 玉米肽對小鼠肝臟蛋白質羰基含量的影響（±SD，n=10）Table 5 Effect of corn peptide on mice in liver tissue protein carbonyl（±SD，n=10）

注：*表示較之模型對照組p＜0.05，差異顯著；##表示較之正常對照組p＜0.01，差異極顯著。

組別PC/（nmol/mgprot）空白對照組 2.89±0.58模型對照組 5.51±1.16##玉米肽低劑量組 3.72±1.41*玉米肽中劑量組 3.61±1.89*玉米肽高劑量組 3.61±1.40*

較之正常對照組，模型組肝組織中的蛋白質羰基含量升高（p＜0.01）。各劑量組肝組織中PC 含量顯著（p＜0.01）低于模型組。

3 討論與結論

通過脫氫酶代謝乙醇轉變?yōu)橐胰┖罄^續(xù)代謝成乙酸鹽，導致煙酰胺腺嘌呤二核苷酸產(chǎn)生，脂肪酸氧化抑制和脂肪積累，乙醇代謝后還原型輔酶Ⅰ（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）的生成增多，會增強呼吸鏈的活動，故氧化應激是酒精肝毒性的一個特征，同時也在酒精性肝病的發(fā)展中起重要作用[5]。本研究以小鼠肝臟和血液中的GSH、MDA 含量以及抗氧化酶系SOD、GSH-Px 的活性與肝組織蛋白質羰基（protein carbonyl，PC）含量為檢測指標，探究玉米肽對小鼠乙醇氧化損傷模型的抗氧化程度。結果顯示各指標模型組較之空白組均有顯著差異，提示本實驗造模成功，分析各指標可得，非酶類抗氧化劑GSH 和抗氧化酶系SOD 與GSH-Px 均在血清和肝臟中表現(xiàn)出顯著的差異（p＜0.01），此外肝組織PC 在各劑量組中均顯示出了顯著差異（p＜0.05），而MDA 僅在高劑量組血清中有顯著性差異（p＜0.05），肝臟中未有任何顯著性差異（p＞0.05）。

本實驗中的玉米肽平均相對分子質量低于1 000 D，由2～6 個氨基酸構成，可不經(jīng)消化，直接吸收供組織利用，相關研究顯示，水解玉米蛋白粉并經(jīng)過正交試驗后可獲得抗氧化性大幅提升的玉米肽，其抗氧化活性與其相對分子質量具有相關性。DPPH 自由基的清除能力與其分子量顯著相關，相對分子質量在5 000 D以下，隨著相對分子質量的上升而下降[6]。結果表明玉米肽對乙醇誘導的氧化損傷模型小鼠具有抗氧化作用，這可能是通過提升其體積內抗氧化酶系活性、清除體內自由基等途徑實現(xiàn)的。

乙醇誘導肝損傷中的氧化應激和自由基損傷作用一直被認為是極為重要的途徑[7]。一旦出現(xiàn)促氧化劑和抗氧化劑之間的不平衡，作為氧化代謝的副產(chǎn)物產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）就會損害細胞大分子，例如DNA、脂質和蛋白質。研究表明乙醇攝入增加了脂質過氧化產(chǎn)物如MDA 的形成[7]。為了抵消這種氧化應激，細胞同時具有多種抗氧化酶系，其中主要是SOD 和GSH-Px，是細胞遭受氧化應激時進行抵御的重要酶系。由實驗結果可得，MDA 含量在小鼠血清中降低顯著（p＜0.05），同時抗氧化酶系SOD 和GSH-Px 在小鼠體內均表現(xiàn)出了顯著的活力提升（p＜0.01），這表明玉米肽一方面可以激活體內抗氧化酶系，結合其氧化損傷后的自由基，同時可以通過自身直接結合自由基，來降低乙醇對肝臟的損害，降低膜脂損害后產(chǎn)生的大量MDA，進而在機體中起到抗氧化的作用。實驗證據(jù)表明，GSH 是Nrf2 的靶關鍵解毒酶，Nrf2 是抗氧化反應的主要調節(jié)因子，在預防乙醇誘導的氧化應激和脂質積聚方面發(fā)揮著重要作用[8]。植物化學物質可以通過直接結合Keap1 激活Nrf2 共價連接，誘導解毒酶和相關蛋白，在保護細胞免受ROS 施加的自由基應激中起關鍵作用[9-10]。據(jù)此可以解釋本實驗中在GSH 含量上顯示的顯著（p＜0.01）提高。除抗氧化酶系和膜脂受損的評價指標外，蛋白質作為功能繁多的生物大分子存在于體內，也是受到自由基攻擊的主要目標，其側鏈氨基酸的氧化是生命系統(tǒng)的重要信號，蛋白質受損的一個重要標志也就是蛋白質側鏈羰基的形成。因此蛋白質羰基含量的測定是對衡量自由基對機體的損傷程度有著實際意義的指標[11]。本實驗中玉米肽各劑量組均顯著低于空白對照組（p＜0.05），提示玉米肽可以自身結合自由基，在一定程度上防護機體蛋白質受自由基損害。

本實驗結果顯示在一定劑量下，由新疆地區(qū)特色粉質型玉米所研發(fā)的玉米肽具有抗氧化功能，這為該地區(qū)玉米開發(fā)具有保肝護肝及抗氧化功能產(chǎn)品提供了一定的理論依據(jù)，并拓展了該地區(qū)特色玉米品種的商業(yè)用途。