杜剛，陸小凱，詹夢濤，婁水珠，陳靜，楊海英，

（1.云南民族大學民族藥資源化學國家民族事務委員會-教育部重點實驗室，云南 昆明 650500；2.云南民族大學化學與環(huán)境學院，云南 昆明 650500）

果酒是采用新鮮的果實或果汁作為原材料，通過搗碎、發(fā)酵、壓榨以及浸泡等方式釀制而成的飲料酒[1]。因果酒中含有大量的糖、多酚、有機酸、酯類、多種維生素及人類所需的氨基酸等物質(zhì)，營養(yǎng)豐富，適量飲用有益身心健康[2-3]。近年來酒類消費倡導以果酒取代糧食酒，各種果酒的研究引起了廣泛關注[4-7]。果酒釀造中分離和篩選出適合果酒發(fā)酵的菌株是決定果酒質(zhì)量及風味的關鍵因素，要保證高效生產(chǎn)并且提高生產(chǎn)效率，就要篩選出優(yōu)良的生產(chǎn)菌種進行純種發(fā)酵[8-11]。

酵母菌是果酒生產(chǎn)中的主要微生物，釀酒酵母普遍應用于釀制白酒、紅酒、啤酒和果汁飲料的生產(chǎn)，其生物合成過程中會形成多種多樣的代謝產(chǎn)物，從而對食品風味產(chǎn)生重要影響[12-14]。本試驗從市售酒曲樣品中分離出酵母菌，通過26S rDNA 序列分析進行了菌種鑒定，經(jīng)過感官評價初篩獲得性能較優(yōu)的酵母，采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術（solid phase microextraction -gas chromatography/mass spectrometry ，SPME-GC/MS）方法[15-17]對篩選出的酵母菌株在獼猴桃汁培養(yǎng)基中的產(chǎn)香進行研究，為篩選用于果酒生產(chǎn)的酵母菌株提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

試驗所用酒曲為市售酒曲，樣品1：廣西都安縣傳統(tǒng)白酒酒曲；樣品2：廣西河池壯家米香型酒曲；樣品3：浙江金華醬香酒曲；樣品4：福建古田紅曲；樣品5：貴州銅仁玉屏燒酒曲；樣品6：湖北黃石清香型酒曲。

1.1.2 培養(yǎng)基配制方法

酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂（yeast extract peptone dextrose，YPD）固體培養(yǎng)基（1L）：葡萄糖 20 g，蛋白胨20 g，瓊脂 20 g，酵母膏 10 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 自然，121 ℃滅菌20 min，冷卻備用。

YPD 液體培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖 20 g，蛋白胨 20 g，酵母膏 10 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 自然，121 ℃滅菌20 min，冷卻備用。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）（1 L）：葡萄糖 20 g，馬鈴薯 200 g，瓊脂 20 g，蒸餾水1 000 mL，分裝錐形瓶，121 ℃滅菌20 min，冷卻備用。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2PD 潔凈操作臺：蘇凈安泰空氣技術有限公司；ZHWT-2012 恒溫搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；LRH-250-G 恒溫干燥培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；YXQ-LS-100SII 立式壓力蒸汽滅菌器鍋：上海博迅實業(yè)有限公司；THERMOFISHER（ISQ）氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀、TR-5MS（30m×0.25mm×0.25μm）毛細管色譜柱：美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司；手動固相微萃取裝置、100μm 聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxcane，PDMS）固相微萃取頭：安捷倫科技有限公司；恒溫加熱磁力攪拌器：德國IKA公司；Scout SE 電子天平：奧豪斯儀器（常州）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌的分離純化

取1 g 酒曲樣品，放入裝有100 mL 無菌蒸餾水的錐形瓶中，恒溫搖床振蕩10 min 將樣品充分打散、混勻，用雙層的無菌紗布過濾，樣品稀釋至10-2～10-7。分別將上述6 個濃度的稀釋液用移液槍移取0.2 mL 于不同的PDA 固體培養(yǎng)基上，每個梯度做3 個平行并分別做好標記。靜置1 min 于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48 h 后觀察并記錄。挑取具有典型酵母菌形態(tài)特征的菌落，鏡檢為純種后，進行劃線分離，直至得到單菌落。挑取單菌落轉接到YPD 斜面上，標明日期及編號放于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待其長出來后裝入密封袋置于4 ℃冰箱保藏。

1.3.2 酵母菌的鑒定

1.3.2.1 菌種的形態(tài)特征觀察

挑取少量菌種于PDA 平板上劃線純化，28 ℃培養(yǎng)2 d，選取單個菌落制成裝片用光學顯微鏡高倍下觀察其大小、干濕、隆起、顏色、邊緣情況、表面光澤、菌落質(zhì)地等細胞形態(tài)。

1.3.2.2 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增和 DNA 測序

斜面菌種活化后，酵母菌接種于150 mL YPD 液體培養(yǎng)基，27 ℃培養(yǎng) 3 d～4 d，培養(yǎng)物 13 000 r/min 離心6 min，收集菌體，液氮凍融-十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）提取 DNA。26S rDNA D2 PCR擴增引物NL1：5′ -GCATATCAATAAGCG GAGGAAAAG -3′ 和 NL4：5′ -GGTC CGTGTTTCAAG-3′。PCR 反應體系為：Taq MIX 25 μL，Bestaq MasterMix/with dye（25 μL），引物各 2.5 μL，模板5 μL，加無酶水補足 50 μL。程序為：95 ℃預熱 3 min，95 ℃變性 10 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，72 ℃終延伸 5 min，30 個循環(huán)后 72 ℃末端延伸 10 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物以瓊脂糖電泳檢測，測序由昆明碩擎生物科技有限公司完成。

1.3.2.3 26S rDNA 基因序列測定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

酵母菌分析所得DNA 序列用DNAMAN 生物軟件進行拼接，用MEGA6.0 進行酵母序列的同源性比對（Alignment）和利用鄰接（neighbour-joining，NJ）法系統(tǒng)發(fā)育樹構建[18]。

1.3.3 酵母菌的篩選

將“1.3.1”分離得到的菌株分別接種到YPD 培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng) 3 d～5 d 以后，通過感官分析[19]篩選出具有果香和略帶花香氣味的菌株，將初篩獲得的酵母菌接種到獼猴桃汁液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)3 d～5 d，再通過感官分析篩選出具有比較濃郁的酒香味或獨特果香味的菌株。

1.3.4 酵母菌的發(fā)酵產(chǎn)香研究

獼猴桃干果與水按1 ∶9 的質(zhì)量比混合，浸泡30 min，攪拌機打碎得到獼猴桃汁培養(yǎng)基。將1.3.3 篩選得到的酵母菌接種到獼猴桃汁培養(yǎng)基中活化24 h后，以5.0%接種量接種于裝有200 mL 獼猴桃汁的三角瓶中，發(fā)酵溫度為28 ℃，發(fā)酵時間10 d。發(fā)酵液過濾后得到獼猴桃汁發(fā)酵樣品。

1.3.5 揮發(fā)性成分分析

1.3.5.1 揮發(fā)性成分的提取

利用手動頂空固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）法對獼猴桃汁發(fā)酵樣品中揮發(fā)性物質(zhì)進行富集，取發(fā)酵樣品5 mL 于樣品瓶中，加入0.5 g NaCl，將老化好的萃取頭插入到樣品瓶頂空部分，在45 ℃的恒溫磁力攪拌器上，轉速為180 r/min 條件下萃取 30 min，GC 進樣口（溫度 240 ℃）解吸附 1 min，用于氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析。

1.3.5.2 氣相色譜質(zhì)譜工作條件

色譜條件為TR-5MS 毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度 240 ℃；載氣為氦氣；柱流量為1 mL/min；進樣模式：分流模式（分流比為 10 ∶1）。

程序升溫：起始溫度為 30 ℃，保持 2 min，以5 ℃/min 的速率升至 80 ℃保持 1 min，以 10 ℃/min 的速率升溫至100 ℃保持1 min，以20 ℃/min 的速率升溫至230 ℃保持1 min。

質(zhì)譜條件：EI 離子源，電子能量為70 eV，倍增器電壓1 600 V。質(zhì)譜掃描范圍為10 a.m.u ～500 a.m.u，掃描方式：全掃描，掃描速度：0.2 scan/s。離子源溫度：255 ℃，傳輸線溫度：265 ℃。

各組分通過Nist11 譜庫檢索進行定性分析，運用面積百分比法計算相對百分含量。

2 結果與分析

2.1 酵母菌的分離和初篩結果

從6 種酒曲中共分離出10 株酵母菌，其中從樣品1 分離出2 株，編號CK01、CK02；從樣品2 分離出2株，編號CK03、CK04；從樣品3 分離出1 株，編號CK05；從樣品 4 分離出 2 株，編號 CK06、CK07；從樣品5 分離出 1 株，編號 CK08；從樣品 6 分離出 2 株，編號CK09、CK10。

通過感官分析初步篩選出酒香型酵母菌2 株（CK03、CK10），濃香型酵母菌5株（CK01、CK02、CK04、CK05、CK07），清香型酵母菌 3 株（CK06、CK08、CK09）。

2.2 酵母菌株的形態(tài)鑒定結果

對分離得到的10 株菌株在顯微鏡下進行形態(tài)特征觀察，觀察結果見表1。

表1 酵母菌菌落形態(tài)觀察結果Table 1 The table of yeasts colony morphology

2.3 菌株的分子鑒定

2.3.1 酵母菌株的PCR 結果

10 株酵母菌株PCR 擴增產(chǎn)物片段大小在500 bp～750 bp 之間，如圖1所示。

圖1 10 株酵母菌株PCR 擴增的結果Fig.1 The PCR results of yeasts

2.3.2 酵母ITS 序列相似性Blast 查詢結果

酵母ITS 序列相似性Blast 查詢結果見表2。

表2 酵母ITS 序列相似性Blast 查詢結果Table 2 ITS sequence of yeasts similarity Blast query results

2.3.3 酵母菌菌株系統(tǒng)進化樹

測序結果用Blast 在GenBank 中進行同源性比對，選取模式菌株以領域連接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖2。

由圖2可知，所測10 株酵母菌中有3 株酵母菌均同為 Pichia kudriavzevii，3 株酵母菌為 Saccharomyces cerevisiae，1 株酵母菌為 Pichia anomala，2 株酵母菌為Kluyveromyces marxianus，1株酵母菌為Clavispora lusitaniae。

2.4 獼猴桃汁發(fā)酵樣品揮發(fā)性成分分析

通過“1.3.3”試驗篩選出的酵母菌CK-03 用于發(fā)酵產(chǎn)香研究，對發(fā)酵樣品采用GC-MS 分析，總離子流圖見圖3。

經(jīng)過Nist11 譜庫檢索得到揮發(fā)性化合物的種類，計算相對含量結果見表3。

圖2 酵母菌菌株基于26S rDNA 的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of yeast strains based on 26S rDNA analyses

圖3 酵母CK-03 發(fā)酵樣品揮發(fā)性成分的GC-MS 總離子流圖Fig.3 Total ion chromatograms of volatile components with yeast strains CK-03 fermentation

表3 酵母CK-03 發(fā)酵樣品的主要揮發(fā)性成分Table 3 Volatile components with yeast strains CK-03 fermentation

樣品共檢出25 種揮發(fā)性成分，其中酯類10 種，醇類 4 種，酸類6 種、醛類 1 種、烷烴2 種。醇類物質(zhì)和酯類物質(zhì)是構成發(fā)酵樣品香氣的主要成分，醇類組分含量較高，其中異戊醇、苯乙醇、2-甲基丁醇的相對含量分別為25.64%、8.18%、7.33%。異戊醇具有酒香和果香的味道，苯乙醇具有呈香、呈味作用[20]。酯類物質(zhì)種類最多，其中乙酸乙酯、4-己烯酸乙酯、辛酸乙酯含量較高，分別為3.93%、2.87%、1.82%，其他酯類還有乙酸異戊酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯等，辛酸乙酯具有白蘭地酒香氣，癸酸乙酯具有果香和花香的香氣[21]，這些酯類產(chǎn)生的香氣相互綜合，賦予發(fā)酵樣品濃郁的酯香。此外，在發(fā)酵樣品中還檢測到6 種酸類、1 種醛類和2 種烷烴。這些物質(zhì)含量底，可能對發(fā)酵樣品香氣的直接貢獻不大，但對發(fā)酵樣品復雜的香氣做出了貢獻。

3 結論

本試驗從種市售酒曲樣品中分離出10 株酵母菌，經(jīng)過形態(tài)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，確定酵母菌CK-02、CK-04、CK-05 為 Pichia kudriavzevii，酵母菌 CK-03、CK-08、CK-10 為 Saccharomyces cerevisiae，酵母菌CK-09 為 Pichia anomala，酵母菌 CK-01、CK-06 為Kluyveromyces marxianus，酵母菌CK-07 為Clavispora lusitaniae，表明不同酒曲的酵母菌株有較大差異。將粗篩后的酵母CK-03 發(fā)酵獼猴桃汁，經(jīng)GC-MS 測定分析，發(fā)酵樣品中含有多種揮發(fā)性成分，主要成分是醇類物質(zhì)和酯類物質(zhì)。CK-03 酵母菌的發(fā)酵工藝特性還有待進一步研究。