潘梓源，林佳漫，鄧乃銓，龔偉軍，葉燕妮，鄭 萱，姜翠翠，周英彪*

（1.廣東石油化工學(xué)院 廣東省嶺南特色果蔬加工及應(yīng)用工程技術(shù)研究中心 廣東普通高校食品科學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，廣東 茂名 525000；

2.廣東石油化工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，廣東 茂名 525000）

桂圓（Dimocarpus longganaLour.）又稱龍眼，為無(wú)患子科龍眼屬植物。桂圓樹為常綠喬木，食用部分是假種皮，乳白或淡白色，肉質(zhì)脆，清甜[1-2]。其果肉含有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有補(bǔ)血安神、健腦益智、補(bǔ)養(yǎng)心脾的功效，是健脾長(zhǎng)智的傳統(tǒng)食物，對(duì)失眠、心悸、神經(jīng)衰弱、記憶力減退、貧血及抗衰老等有益[2-3]。我國(guó)桂圓產(chǎn)業(yè)規(guī)?；?、產(chǎn)品系列化正在形成，傳統(tǒng)產(chǎn)品形式為鮮果、桂圓干及桂圓肉干[4]，深加工產(chǎn)品如桂圓果汁[5]、桂圓果酒[6-7]、桂圓果醋[2，8-9]、發(fā)酵飲料[10-11]及酵素[12]等也有研究開發(fā)。

酵素是近年在歐美日韓等經(jīng)濟(jì)體中新興的一種產(chǎn)品形式，在我國(guó)也極具市場(chǎng)潛力。酵素按用途可分為食用酵素、環(huán)保酵素、日化酵素及飼用酵素。其中，食用酵素是指以動(dòng)物、植物及菌類為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵而制得具有特定生物活性成分可食用的產(chǎn)品[13]。其中對(duì)生物現(xiàn)象有影響的微量或少量物質(zhì)生物活性成分包括多糖類、寡糖類、蛋白質(zhì)及多肽類、氨基酸類、維生素類及醇、酯、酸、酚類等[14]。

酚類化合物是多羥基酚類化合物的總稱，主要包括類黃酮和酚酸兩大類，酚類化合物具有很強(qiáng)的抗氧化作用，被稱為“第七類營(yíng)養(yǎng)素”，除了抗氧化功能外，還有降血脂、抗癌、抗炎癥和凝聚血小板等功能，是近年功能性食品領(lǐng)域熱點(diǎn)研究的生物活性因子[15-16]。水果酚類化合物主要包括單寧或鞣質(zhì)及小分子酚酸類化合物，如花青素、兒茶素、阿魏酸、沒食子酸和鞣花酸等[17]。桂圓果肉中含有多種游離態(tài)和結(jié)合態(tài)酚類化合物[18]，其中已經(jīng)鑒定的酚類化合物有沒食子酸、綠原酸、兒茶素、表兒茶素、4-甲基兒茶酚、蘆丁、槲皮素、柯里拉京（Corillagin）、香豆酸、香草酸、原花青素三聚體A型、短鏈苯甲酰甲酸甲酯及鞣花酸等[19-23]。研究表明，酚類化合物，除了水果中本身自有外，也可通過(guò)微生物發(fā)酵的全細(xì)胞催化作用轉(zhuǎn)化生成[24]，例如乳酸菌發(fā)酵桂圓水提液可以增加發(fā)酵液中游離態(tài)總酚和總黃酮含量，降低結(jié)合態(tài)總酚和總黃酮含量[25]。

近年來(lái)，桂圓發(fā)酵飲料及酵素的相關(guān)研究也有報(bào)道。如龐澤翀等[26]對(duì)龍眼乳酸菌發(fā)酵飲料工藝進(jìn)行了優(yōu)化；葛瑞宏等[12]以胞外多糖含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化了桂圓水提液乳酸菌酵素的發(fā)酵工藝；KHANSA等[22]分析了桂圓水提液乳酸菌發(fā)酵液中酚類化合物及游離氨基酸組成和抗氧化潛力。本研究以桂圓水提液為原料，總酚含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化桂圓酵素的發(fā)酵工藝；并采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析了桂圓酵素中酚類化合物的生物轉(zhuǎn)化情況，為進(jìn)一步研究闡明其轉(zhuǎn)化機(jī)制，進(jìn)而為定向研究開發(fā)富含特定酚類化合物并且具有特定功能的桂圓酵素奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干制桂圓肉：產(chǎn)自廣東省高州市；釀酒酵母（Saccha romycescerevisiae）CGMCC2.3853：中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心；醋酸桿菌（Acetobacterpasteurianus）CICC20064、植物乳酸桿菌（Lactobacillus plantarum）CICC21790：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

綠原酸、阿魏酸、柚皮苷、柚皮素、橙皮素、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（均為色譜純）：北京索萊寶科技有限公司；乙酸乙酯（色譜純）、甲醇（色譜純）：德國(guó)默克公司；福林-酚試劑（分析純）：福州飛凈生物技術(shù)有限公司；Na2CO3（分析純）：購(gòu)自天津市百世化工有限公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：酵母粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%；LB培養(yǎng)基：酵母粉0.5%，蛋白胨1%，NaCl 1%。培養(yǎng)基均在121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

WJS1222F型榨汁機(jī)：美的電器公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器公司；DHZ-DA型臥式恒溫?fù)u床：蘇州培英公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮公司；YP10002電子天平：上海佑科公司；SPT-16A全自動(dòng)氮空吹掃濃縮儀：北京斯珀特公司；Gene1580R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：基因有限公司；L5S型紫外可見分光光度計(jì)：上海儀電公司；LC-20AT高效液相色譜：日本島津公司；InertSustain C18色譜柱：日本GL Sciences公司。

1.3 方法

1.3.1 桂圓酵素的制作工藝與操作要點(diǎn)

蒸餾水 菌種培養(yǎng)→離心去上清↓↓

干制桂圓肉→粉碎→熱水浸提→過(guò)濾→水提液→接種菌體→發(fā)酵→靜置澄清→上清離心過(guò)濾→桂圓酵素

操作要點(diǎn)：

桂圓水提液的制備：取干制桂圓肉打碎成粉末狀，按料液比1∶10加入蒸餾水，70℃水浴浸提1 h，無(wú)菌紗布過(guò)濾去渣后，獲得桂圓水提取液。

菌株培養(yǎng)：分別培養(yǎng)釀酒酵母（YPD培養(yǎng)基，接種量0.1%，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)）、醋酸桿菌（LB培養(yǎng)基，接種量0.1%，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)）與植物乳酸桿菌（LB培養(yǎng)基，接種量0.1%，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)）至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期。

接種發(fā)酵：按10%接種量量取菌液，10 000 r/min、4℃條件下離心10min，棄上清液取菌體，無(wú)菌生理鹽水洗滌菌體2次（重懸菌體后離心棄上清液）。桂圓水提取液分裝每瓶120 mL，按單因素及正交試驗(yàn)要求接入相應(yīng)的菌株或組合菌株，培養(yǎng)發(fā)酵。

離心與過(guò)濾除菌：發(fā)酵液靜置澄清2h后，取上清8000r/min離心10 min，取上清0.45 μm濾膜過(guò)濾，即得桂圓酵素。

1.3.2 桂圓酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

分別考察菌株組合（①釀酒酵母；②醋酸桿菌；③植物乳酸桿菌；④釀酒酵母＋醋酸桿菌；⑤釀酒酵母＋植物乳酸桿菌；⑥醋酸桿菌＋植物乳酸桿菌；⑦釀酒酵母＋醋酸桿菌＋植物乳酸桿菌）、發(fā)酵溫度（28℃、30℃、32℃、34℃、36℃及38℃）及發(fā)酵時(shí)間（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h及72 h）對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)后桂圓酵素中的總酚含量的影響。初始發(fā)酵條件為：菌株組合比例1∶1和1∶1∶1，桂圓水提取液量120 mL，接種量10%（菌株活化培養(yǎng)與洗滌后接入菌體），發(fā)酵溫度30℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，發(fā)酵時(shí)間24 h。

1.3.3 桂圓酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取菌株組合、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，以發(fā)酵培養(yǎng)后桂圓酵素中的總酚含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最優(yōu)桂圓酵素發(fā)酵工藝。

1.3.4 總酚含量測(cè)定

按照參考文獻(xiàn)[27]以O(shè)D765nm值（x）為橫坐標(biāo)，以沒食子酸質(zhì)量濃度（y）為縱坐標(biāo)，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線y=8.514 9x-0.499 2，R2=0.996 2。

樣品總酚含量的測(cè)定：預(yù)試驗(yàn)確定樣品合適的稀釋倍數(shù)后用蒸餾水稀釋樣品，量取稀釋樣品0.25 mL于10 mL具塞的定容試管中，加入福林-酚試劑1 mL及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的Na2CO3溶液2 mL，蒸餾水定容至10 mL，室溫下避光反應(yīng)1 h，測(cè)定OD765nm值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程確定樣品中總酚含量。

1.3.5 HPLC分析桂圓酵素中的酚類化合物

酚類化合物的萃取：取樣液（桂圓水提液或發(fā)酵液）50 mL，8000r/min離心20min，取上清液于80℃水浴10min，再次8000r/min離心20min，去除沉淀的雜蛋白，取上清液。將得到的上清液用1 mol/L的鹽酸溶液調(diào)整pH值至2.0，然后加入20 mL乙酸乙酯萃取，振蕩5 min后靜置分離有機(jī)相和水相，保留有機(jī)相；取水相加入20 mL乙酸乙酯重復(fù)萃取1次，保留有機(jī)相；兩次萃取后的水相，加入6.0 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值至6.0，加入20 mL乙酸乙酯萃取，振蕩5 min后靜置分離有機(jī)相和水相，保留有機(jī)相[28]。將所有有機(jī)相合并，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中30℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約3mL左右，然后于氮吹儀中接入氮?dú)獯蹈?，用甲醇（色譜純）反復(fù)沖洗并定容至1 mL，過(guò)0.22 μm濾膜后，進(jìn)行HPLC分析。

酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)品配制：精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品綠原酸、阿魏酸、柚皮苷、柚皮素及橙皮素各0.001 0 g，分別用超純水溶解，并定容至10mL，取1mL過(guò)0.22μm濾膜后，進(jìn)行HPLC分析。

HPLC檢測(cè)酚類化合物：用島津LC-20AT高效液相色譜儀對(duì)酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)品、桂圓水提液及發(fā)酵液中酚類化合物進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)條件：C18柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）。洗脫方案：雙溶劑梯度流動(dòng)相為超純水（A）和甲醇（B）。梯度設(shè)定為：0～20 min，37%～50%A；20～35 min，50%～80%A；35～40 min，80%～100%A；40～50 min，100%A；50～70min，37%A。流動(dòng)相流速0.7mL/min；柱溫35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)283nm；進(jìn)樣量5μL。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

單因素及正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0進(jìn)行處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桂圓酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 菌種組合

發(fā)酵菌株組合對(duì)桂圓酵素總酚含量的影響如圖1所示。由圖1可知，組合①、④、⑦與組合②差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明菌株組合對(duì)桂圓酵素的總酚含量有顯著影響。因此，選取組合①、④、⑦進(jìn)行桂圓酵素發(fā)酵正交試驗(yàn)。

圖1 發(fā)酵菌株組合對(duì)桂圓酵素總酚含量的影響Fig.1 Effect of fermentation strains combination on total phenoliccontent of longan ferment

2.1.2 發(fā)酵溫度

發(fā)酵溫度對(duì)總酚含量的影響結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，在28～38℃范圍內(nèi)，桂圓酵素中總酚含量隨發(fā)酵溫度的升高，呈先增加后降低的趨勢(shì)。在發(fā)酵溫度38℃時(shí)總酚含量最低，與最小值（38℃）比較，28℃、30℃、32℃及34℃時(shí)的4個(gè)溫度水平均差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明發(fā)酵溫度對(duì)桂圓酵素的總酚含量有顯著影響。選取其中總酚含量高的28℃、30℃、32℃三個(gè)溫度水平，進(jìn)行桂圓酵素發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)。

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)桂圓酵素總酚含量的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on total phenolic content oflongan ferment

發(fā)酵時(shí)間對(duì)總酚含量影響的結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，在12～72 h范圍內(nèi)，桂圓酵素中總酚含量隨發(fā)酵時(shí)間的升高，呈先增加后降低的趨勢(shì)。發(fā)酵時(shí)間為12 h時(shí)總酚含量最低，與最小值（12 h）比較，其他5個(gè)時(shí)間水平均有顯著差異（P＜0.05），說(shuō)明發(fā)酵時(shí)間對(duì)桂圓酵素的總酚含量有顯著影響。選取其中總酚含量高的24 h、36 h、48 h三個(gè)發(fā)酵時(shí)間水平，進(jìn)行桂圓酵素發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)桂圓酵素總酚含量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on total phenolic content oflongan ferment

2.2 桂圓酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取菌株組合（A）、發(fā)酵溫度（B）及發(fā)酵時(shí)間（C），進(jìn)行3因素3水平（L9（33））正交試驗(yàn)，優(yōu)化桂圓酵素的發(fā)酵工藝，結(jié)果與分析如表1所示。2.3 HPLC分析桂圓酵素的酚類化合物

表1 桂圓酵素發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 1 Results and analysis of orthogonal experiments for longan ferment fermentation conditions optimization

利用正交試驗(yàn)確定的最優(yōu)工藝進(jìn)行桂圓酵素發(fā)酵，發(fā)酵后對(duì)桂圓水提液和桂圓酵素進(jìn)行高效液相色譜分析，結(jié)果見圖4。

圖4 混合標(biāo)準(zhǔn)品（A）、桂圓水提液（B）及酵素（C）中多酚類化合物的HPLC圖Fig.4 HPLC chromatogram of phenolic compounds in mixed standards(A),water extract(B)and longan ferment(C)

菌株組合、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間這3個(gè)因素所對(duì)應(yīng)的極差（R）為RC＞RB＞RA，從而得知影響桂圓酵素發(fā)酵的主次因素依次為發(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度＞菌株組合。由極差分析可知，桂圓酵素發(fā)酵工藝的最優(yōu)方案為A3B2C2。即發(fā)酵菌株組合為⑦（釀酒酵母+醋酸桿菌+植物乳酸桿菌）、發(fā)酵溫度為30℃、發(fā)酵時(shí)間為36h。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明，桂圓酵素的總酚含量達(dá)（46.05±0.76）μg/mL，是桂圓水提液總酚含量（9.12±0.26）μg/mL的5.05倍。此條件下生產(chǎn)的酵素營(yíng)養(yǎng)、功能及衛(wèi)生指標(biāo)符合要求。

由圖4可知，與桂圓水提液（圖4B）比較，桂圓酵素（圖4C）酚類化合物的總含量與種類均明顯增加。在桂圓水提液中檢測(cè)到的酚類化合物至少有10種，其中含量較高的保留時(shí)間集中在3～8 min（圖4B）；含量較低的酚類化合物保留時(shí)間集中在8 min后，至少有11種；參照標(biāo)準(zhǔn)品（圖4A）可以確定其中1種為綠原酸（圖4B中峰1）。桂圓酵素中至少含有20余種酚類化合物，含量較高的保留時(shí)間集中在3～11min及16～21 min；參照標(biāo)準(zhǔn)品（圖4A）可以確定其中2種為綠原酸及柚皮苷（圖4C中的峰1，峰3）。

進(jìn)一步比較桂圓水提液（圖4B）與桂圓酵素（圖4C）的HPLC圖譜發(fā)現(xiàn)，峰B1與峰C2、峰B2與峰C3、峰B8與峰C15、峰B9與峰C17的保留時(shí)間分別一致，所以它們應(yīng)分別為同一種酚類物質(zhì)。因此除此上述4種酚類化合物及綠原酸之外，桂圓水提液中所檢測(cè)到的其他酚類化合物，經(jīng)發(fā)酵后均被完全轉(zhuǎn)化。桂圓酵素（圖4C）中至少有16個(gè)峰的保留時(shí)間與桂圓水提液不一致，說(shuō)明桂圓酵素中至少有16種酚類化合物為新生成；對(duì)新生成16酚類化合物與5種標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間進(jìn)行比較，可以確定其中1種為柚皮苷（圖4C中峰3）；對(duì)應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)品按峰面積進(jìn)行計(jì)算，桂圓酵素中柚皮苷含量為3.32 μg/mL。桂圓水提液中某些酚類化合物的完全被轉(zhuǎn)化，及桂圓酵素中新生成了桂圓水提液中原來(lái)沒有的酚類化合物，是釀酒酵母、醋酸桿菌與植物乳酸桿菌協(xié)同催化的結(jié)果，將在后續(xù)研究中進(jìn)一步研究其協(xié)同催化機(jī)制與催化效率。

3 結(jié)論

以總酚含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化后的桂圓酵素發(fā)酵工藝為：發(fā)酵菌株組合釀酒酵母＋醋酸桿菌＋植物乳酸桿菌（1∶1∶1）、接種量10%、發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時(shí)間36 h。在此工藝條件下，桂圓酵素的總酚含量達(dá)（46.05±0.76）μg/mL，是桂圓水提液總酚含量（9.12±0.26）μg/mL的5.05倍。原桂圓水提液中檢測(cè)到的10多種酚類化合物，在最優(yōu)工藝條件下，除了綠原酸及其他4種酚類化合物外，其余酚類化合物經(jīng)發(fā)酵后均被完全轉(zhuǎn)化。最優(yōu)工藝條件下制得的桂圓酵素中至少含有20余種酚類化合物，至少有16種為新生成；新生成的酚類化合物中的1種可以確定為柚皮苷，其在桂圓酵素中含量達(dá)3.32 μg/mL。