周金沙，陳曉藝，譚金萍，陳夢娟，李笑怡，蔣立文*，黃 海

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；

2.長沙市食品藥品檢驗所，湖南 長沙 410016；

3.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗室，湖南 長沙 410128；

4.柳州市美申園食品科技有限公司，廣西 柳州 545100）

竹筍（bamboo shoot）是禾本科多年生植物竹子的嫩莖，一般有春筍、冬筍、夏秋季節(jié)毛竹筍等，種類多，適應(yīng)性強(qiáng)，分布廣，除部分鮮食外大部分干制食用。鮮竹筍含有豐富的營養(yǎng)并且味道鮮美，膳食纖維豐富，但因其采收期短、易纖維化及對貯藏條件要求高等問題[1-3]，因此我國每年有超過60%的鮮竹筍原料被用來加工制成筍干及即食調(diào)味筍等產(chǎn)品[4]。酸筍是以鮮竹筍為原料，配以符合飲用要求的水，不加鹽直接浸泡，自然發(fā)酵而具有特殊風(fēng)味的特色食材。鮮竹筍經(jīng)泡制發(fā)酵后不僅風(fēng)味獨(dú)特，還可以延長其的保存期[5-6]，在我國南方地區(qū)及東南亞部分國家都有食用酸筍的習(xí)慣。

酸筍在泡制過程中形成特殊的風(fēng)味和特殊滋味，除了部分來源于竹筍本身營養(yǎng)成分外，與微生物參與代謝有密切關(guān)系[7-8]，因此研究和分析酸筍泡制中微生物菌群結(jié)構(gòu)對于揭示酸筍風(fēng)味及酸筍營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化具有重要作用。SINGHAL P等[9]以印度東北部地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵竹筍為原料，通過生理生化試驗發(fā)現(xiàn)發(fā)酵大筍中乳酸桿菌屬（Lactobacillus）占絕對優(yōu)勢，采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法從樣品中分離得到13株菌，其中有8株均為乳桿菌屬。TAMANG B等[10]對印度東北部地區(qū)發(fā)酵竹筍制品mesu、soidon、soibum和soijim中的乳酸菌進(jìn)行分離并結(jié)合隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性脫氧核糖核酸標(biāo)記-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（randomamplifiedpolymorphic deoxyribonucleicacidpolymerasechainreaction，RAPD-PCR）、16S核糖體核糖核酸（ribosomal ribonucleic acid，rRNA）基因測序和脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）探針雜交技術(shù)等方法對乳酸菌進(jìn)行基因型鑒定，發(fā)現(xiàn)其中的主要功能性乳酸菌有短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、Leuconostocfallax、乳酸明串珠菌（Leuconostoc lactis）等。THAKURK等[11-12]從非鹽漬酸性發(fā)酵食品soidon的液體發(fā)酵劑“soidon mahi”中共分離得到163株菌，通過擴(kuò)增核糖體DNA限制性內(nèi)切酶分析（amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA）、16S rDNA測序和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）分析發(fā)現(xiàn)，該種酸性發(fā)酵劑的pH值為4.50±0.15，其中主要的細(xì)菌菌屬為芽孢桿菌（Bacillus）和乳桿菌屬（Lactobacillus）。目前有關(guān)于酸筍的外文文獻(xiàn)中多以乳酸菌為研究重點(diǎn)，而國內(nèi)有一些關(guān)于竹筍加鹽腌制過程中微生物多樣性的研究報道[13-16]，低鹽發(fā)酵過程中乳酸菌相對較多，高鹽發(fā)酵微生物差異很大。但目前還沒有采用泡制不加鹽發(fā)酵過程中微生物群落變化的相關(guān)研究。

本試驗以10年老酸水發(fā)酵酸筍樣品（bamboo shoot full aged fermentation，BSFAF）、泉水發(fā)酵6個月塊狀酸筍樣品（massivebambooshootfermentation，MBSF）和絲狀酸筍樣品（filamentous bamboo shoot fermentation，F(xiàn)BSF）為研究對象，采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對其細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究，初步探索酸筍細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)，對比不同發(fā)酵時長和不同原料形狀對樣品中菌群結(jié)構(gòu)的影響，為后續(xù)探索風(fēng)味物質(zhì)的形成與竹筍成分、微生物之間的相關(guān)性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

新鮮竹筍（毛竹筍）：廣西省柳州市桂平縣；10年老酸水及泉水：廣西省柳州市桂平縣；10年老酸水發(fā)酵酸筍樣品（BSFAF）、利用泉水發(fā)酵6個月的塊狀酸筍樣品（massive bamboo shoot fermentation，MBSF）、絲狀酸筍（filamentous bamboo shoot fermentation，F(xiàn)BSF）樣品：由實(shí)驗室自制。

1.1.2 化學(xué)試劑

Phusion熱啟動Flex 2X預(yù)混液（Pusion Hot Start Flex 2X Master Mix）：上海儀濤生物儀器有限公司；DL2000 DNA Marker：日本Takara公司；核酸定量分析試劑盒（QubitdsDNA HSAssayKit）：美國英杰生命技術(shù)有限公司；BiowestAgarose瓊脂糖G-10：法國Biowest公司；50×TAE 緩沖液：上海生工生物工程股份有限公司；AxyPre聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（poly merase chain reaction，PCR）清潔試劑盒：美國愛思進(jìn)公司；RStool DNA試劑盒：美國Omega公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5424型常溫離心機(jī)：德國Eppendorf公司；Biocen 22 R冷凍離心機(jī)：德國WIGGENS公司；WH-861型旋渦振蕩儀：太倉華利達(dá)實(shí)驗室設(shè)備公司；DK-8D型三溫三控恒溫水浴鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；A200型PCR儀：杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；MiSeq測序儀：美國Illumina公司；EPS300型電泳儀、Tanon-2500型凝膠成像儀：上海天能公司；DWHL388型超低溫冷凍儲存箱：中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司；水系微孔濾膜（Φ50mm，孔徑0.22微米）：海寧郭店桃園膜分離設(shè)備廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 酸筍制作方法

將新鮮竹筍外殼去除后用清水清洗，切成塊狀或條狀，然后裝入容器中填滿，并添加泉水將其完全覆蓋后，以保鮮膜封口再蓋上蓋子進(jìn)行密封發(fā)酵。10年老酸水發(fā)酵酸筍樣品則是以加工成塊狀的新鮮竹筍泡入10年老酸水中，并按上述步驟進(jìn)行密封發(fā)酵。

1.3.2 酸筍樣品總DNA提取

將發(fā)酵6個月的塊狀酸筍樣品（MBSF）、絲狀酸筍（FBSF）樣品和以10年老酸水發(fā)酵酸筍樣品（BSFAF）攪拌均勻后各取50g，然后用孔徑為0.22μm的水系微孔濾膜進(jìn)行抽濾。將抽濾完成后的濾膜剪碎放入微型離心管中，按照RStool DNA試劑盒說明書提取總DNA。

1.3.3 酸筍16S rDNA高通量測序方法

以酸筍總DNA為模板，進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA V3-V4區(qū)域擴(kuò)增。引物為：338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。

PCR擴(kuò)增體系：25 μL包含DNA模板25 ng、上下游引物各為2.5 μL、12.5 μL PCR預(yù)混合物。

PCR擴(kuò)增條件：98℃預(yù)變性30 s；98℃變性10 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環(huán)35次；最后72℃延伸10 min。

取PCR產(chǎn)物10 μL用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，將檢測合格樣品送至杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司進(jìn)行高通量測序。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

對下機(jī)數(shù)據(jù)首先根據(jù)樣品的條形碼（barcode）信息對數(shù)據(jù)進(jìn)行拆分，再根據(jù)雙端序列的重疊（overlap）關(guān)系將序列拼接（merge）成長的tags，并將序列上建庫引入的barcode和引物序列去除。為了保證后續(xù)結(jié)果的可靠性，使用Vsearch（V2.3.4）軟件過濾去除長度小于100 bp的序列、含不確定堿基達(dá)5%以上的序列及嵌合體序列等低質(zhì)量序列[17]。再以平均鄰近聚類算法通過Verseach（V2.3.4）將具有97%以上相似性的序列劃分為同一個操作分類單元（operational taxonomic units，OUT）[18-19]，挑選代表性序列使用。在核糖體數(shù)據(jù)庫項目（ribosomal database project，RDP）中進(jìn)行序列比對，明確序列的分類地位。利用MAFFT（V 7.310）軟件對不同類群優(yōu)勢種群的差異進(jìn)行多序列比對，研究不同OTU間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。同時，可根據(jù)每個OTU代表序列與RDP數(shù)據(jù)庫的比對，獲得到各樣本的物種注釋結(jié)果[20-21]，經(jīng)過分類統(tǒng)計后可得到各分類水平上物種的相對豐度信息。使用Verseach（V2.3.4）計算樣品的各項數(shù)據(jù)指標(biāo)，通過Alpha和Beta多樣性分析研究單個樣本中物種的多樣性和多個樣本間菌群結(jié)構(gòu)的差異[22-23]。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

按照生物學(xué)樣品處理基本要求，所有樣品均有3個生物學(xué)重復(fù)樣品。采用SPSS 18.0和Excel 2019進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 三個不同樣品測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

通過IlluminaMiSeq測序后9個樣品共產(chǎn)生了148656條有效數(shù)據(jù)（ValidTags），本次測序有效數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果見表1。

表1 有效數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 1 Statistics of effective data

由表1可知，堿基質(zhì)量值＞20%（Q＞20%）和30%（Q＞30%）的數(shù)據(jù)均在90%以上，平均長度為418.89 bp，表明此次測序質(zhì)量較好，可進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

2.2 三個不同樣品OTUs統(tǒng)計及分類學(xué)分析

對測序獲得的148656條有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，OTUs聚類后3組樣品中總共得到1116個OTUs，根據(jù)3組樣品中的OTUs聚類繪制的Venn圖見圖1。

圖1 三個樣品中OTU分布Venn圖Fig.1 Venn diagram of OTU distribution in three samples

由圖1可知，F(xiàn)BSF、BSFAF和MBSF樣品中OTUs的數(shù)目分別為537、461及391，而3組樣品中共有的OTUs僅有25種。FBSF和BSFAF共有57種，F(xiàn)BSF和MBSF共有191種，BSFAF和MBSF共有50種。對FBSF和MBSF樣品中OTUs數(shù)目進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，在相同試驗條件下泡制的不同形狀的竹筍中細(xì)菌菌群數(shù)量存在差異，說明原料處理方式如全筍發(fā)酵、塊狀發(fā)酵及絲狀發(fā)酵可能對發(fā)酵過程中微生物種類產(chǎn)生影響。另一方面，對比塊狀酸筍和10年老酸水泡制的酸筍的OTU，可以發(fā)現(xiàn)酸水的來源也可能影響微生物數(shù)量。

2.3 三個不同樣品Alpha多樣性分析

Chao1指數(shù)曲線是反映樣品微生物豐富度的指標(biāo)，也可以用來說明樣本的測序數(shù)據(jù)量是否合理。當(dāng)曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的OTU，反之則表明繼續(xù)測序還可能產(chǎn)生較多新的OUT。基于高通量測序技術(shù)對酸筍細(xì)菌的Chao1指數(shù)進(jìn)行分析，Chao1指數(shù)曲線見圖2。

圖2 酸筍樣品稀釋曲線Fig.2 Dilution curves of sour bamboo shoot samples

由圖2可知，隨著測定序列數(shù)目的增加，樣本的Chao1指數(shù)值均＞300，說明3種樣品的物種多樣性和豐富度都較高。從樣品重復(fù)性稀釋曲線情況來說，曲線均趨于相對平緩，測序達(dá)到10000以上基本趨于平緩，可以說明樣品中基本代表樣品OTU實(shí)際情況，能夠反應(yīng)樣品中微生物多樣性豐富程度，可以評價覆蓋所有微生物類群。

3組樣品中細(xì)菌群落多樣性指數(shù)的統(tǒng)計結(jié)果見表2。由表2可知，coverage指數(shù)均＞0.99，因此證明本次實(shí)驗的取樣合理。FBSF的Shannon和Simpson指數(shù)均顯著高于其他酸筍樣品（P＜0.05），分別為3.60和0.85；而MBSF分別為2.89和0.77，低于FBSF；BSFAF這兩個指數(shù)均最低，分別為2.26和0.45，且3組樣品間差異顯著（P＜0.05）。

FBSF的ACE指數(shù)和檢測物種總數(shù)最高，顯著高于其他兩組（P＜0.05），而BSFAF和MBSF兩組的ACE指數(shù)與檢測物種總數(shù)無顯著性差異（P＞0.05），表明BSFAF和MBSF兩組中微生物物種豐富度幾乎相同且與FBSF組顯著不同。這些結(jié)果表明，原料切分的狀態(tài)不同，與酸水接觸面積差異大，可能導(dǎo)致發(fā)酵酸筍中微生物的豐富度與均勻性差異較大。

表2 酸筍樣品中細(xì)菌群落多樣性指數(shù)統(tǒng)計Table 2 Diversity index of fungal community in sour bamboo shoot samples

此外BSFAF和MBSF兩組比較發(fā)現(xiàn)，雖然不同來源酸水泡制的樣品中物種數(shù)量差異不顯著（P＞0.05），但MBSF中微生物菌群的豐富度和均勻性顯著高于10年老酸水泡制的酸筍（P＜0.05）。由此說明以泉水泡制發(fā)酵酸筍可能更好。

綜上，F(xiàn)BSF的Alpha多樣性優(yōu)于其他組，由此說明絲狀發(fā)酵的酸筍在微生物多樣性上有明顯優(yōu)勢。

2.4 三種不同樣品Beta多樣性分析

對測序獲得的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行Beta多樣性分析，采用R語言vegan包進(jìn)行相似性分析，基于weighted unifrac和unweighed unifrac兩種距離算法，來檢驗組間的差異顯著性，結(jié)果見表3。

表3 相似性分析結(jié)果Table 3 Results of analysis of similarities

由表3可知，在weighted unifrac和unweighed unifrac兩種距離算法下，相關(guān)系數(shù)R分別為1.00和0.99，且P值均＜0.01，表明樣本間的Beta多樣性差異很大。

3個樣品主坐標(biāo)分析（principalcoordinateanalysis，PCoA）結(jié)果見圖3。由圖3可知，在weighted unifrac算法下，其坐標(biāo)軸1、2主要貢獻(xiàn)度之和為99.52%，表明已經(jīng)可以較好地反映各樣本在圖上的種群結(jié)構(gòu)差異，計算3組樣本在圖3中點(diǎn)的分布距離可以看出，F(xiàn)BSF和MBSF兩組距離較近，但與BSFAF組的距離遠(yuǎn)，表明FBSF和MBSF樣品中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)比較接近，與BSFAF組中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)差異較大，可能與兩個6個月發(fā)酵樣品發(fā)酵條件類似有關(guān)，但10年老酸水發(fā)酵酸筍酸水中積累了較多菌群，因此菌群結(jié)構(gòu)才會出現(xiàn)較大的差異。

圖3 主坐標(biāo)分析結(jié)果Fig.3 Results of principal coordinate analysis

2.5 三種不同樣品中物種注釋及分類

將前面分析獲得的OTU代表序列與核糖體數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，門分類水平上樣品菌群差異結(jié)果見圖4，屬分類水平上樣品菌群差異結(jié)果見圖5和圖6。

由圖4可知，在門分類水平上，3組樣品中共注釋到12個門類，分別是厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）、未知細(xì)菌類（Bacteria unclassified）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、Candidatus Saccharibacteria、梭桿菌門（Fusobacteria）、芽單孢菌門（Gemmatimonadetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）及綠彎菌門（Chloroflexi）。FBSF、MBSF和BSFAF 3組樣品中厚壁菌門（Firmicutes）是占絕對優(yōu)勢的門類，平均相對豐度分別為99.94%、87.02%和92.64%，其次是變形桿菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）。3組樣品中BSFAF組中注釋到細(xì)菌門類最多有11個，而FBSF組和MBSF組樣品中注釋的門類較少，各有3個，這可能是因為10年老酸水在長期重復(fù)發(fā)酵中有微生物沉積，所以細(xì)菌門類最多。

圖4 門分類水平上樣品相對豐度Fig.4 Relative abundance of sample at the phylum classification level

圖5 屬分類水平上樣品相對豐度Fig.5 Relative abundance of sample at the genus classification level

屬分類水平上的物種注釋圖和熱圖分別見圖5和圖6。由圖5和圖6可知，在FBSF、MBSF和BSFAF3組樣品中的優(yōu)勢菌屬均為乳桿菌屬（Lactobacillus）。其次，從FBSF和MBSF兩組中可看出，雖然試驗條件相同，但塊狀和絲狀酸筍樣品中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)存在較明顯的差異，F(xiàn)BSF組中的乳桿菌屬（Lactobacillus）顯著高于塊狀酸筍（MBSF）組，其平均相對豐度分別為85.39%和66.66%。但3組樣品中，僅MBSF組中乳球菌屬（Lactococcus）的平均相對豐度最高（平均相對豐度為23.39%）。造成這樣差異的原因可能是與原料的加工程度有關(guān)，當(dāng)原料被切絲后使竹筍中的內(nèi)生菌外流并且參與到發(fā)酵過程中。最后，對比BSFAF組與發(fā)酵6個月的兩種酸筍樣品組的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)可發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵時間更長的無鹽泡制酸筍中細(xì)菌種類較其他兩組更多，這可能是發(fā)酵時間長，老酸水可以作為下一批次發(fā)酵“引子”的物質(zhì)基礎(chǔ)。這也說明10年老酸筍水中的微生物菌群一直處于動態(tài)變化中，從而在菌群結(jié)構(gòu)及豐度上與發(fā)酵時間短的的酸筍混合樣品存在較大差異。

圖6 屬分類水平上熱圖分析Fig.6 Heatmap analysis at genus level

此外對3組樣品中常見益生菌菌屬：乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）和魏斯氏菌屬（Weissella）的平均相對豐度的總和進(jìn)行統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BSF組中平均相對豐度的總和最高，可達(dá)99.8%，這3個屬的相對豐度含量分別為85.39%、5.52%和8.88%；其次是MBSF組，平均相對豐度的總和為91.17%，3種菌相對豐度分別為66.66%、23.39%和1.07%；而BSFAF組中最低，總和依然能達(dá)到81.94%，3種菌相對豐度分別為80.90%、0.52%和0.52%。這些結(jié)果與洪秀榮[13]采用干筍糟制過程乳酸菌包括發(fā)酵乳桿菌、片球菌、鏈球菌、腸膜明串珠菌有部分相似。夏秀娟等[14]研究發(fā)現(xiàn)，中等鹽濃度研制麻竹筍，腌制過程中乳酸乳球菌含量逐漸升高，腌制14 d達(dá)到最大值時增加了6個數(shù)量級。夏秀娟等[15]研究高鹽腌制麻竹筍的細(xì)菌群落組成及低鹽腌制筍中微生物發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)低濃度鹽發(fā)酵主要包括綠色氣球菌、乳球菌屬、食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、芽孢桿菌屬，高鹽鹽漬以綠色氣球菌（Aerococcus viridans）、芽孢桿菌屬（Bacillussp.）等[16]為主。本研究采用的新鮮麻竹筍不加鹽直接泡制發(fā)酵，與高、中、低鹽研制酸筍發(fā)酵結(jié)果相比，乳酸菌相對含量極高，并且Enterobacteriaceaeunclassified、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）及腸球菌屬（Enterococcus）等具有潛在危害的菌屬的含量極低，因此，無鹽發(fā)酵酸筍可能更有利于發(fā)酵及生產(chǎn)。3結(jié)論

本試驗采用高通量測序技術(shù)對10年老酸水泡制的酸筍樣品（BSFAF）及用泉水泡制發(fā)酵6個月塊狀（MBSF）和絲狀酸筍樣品（FBSF）中細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究。在3組樣品中共注釋到12個門、23個綱、37個目、98個科、190個屬。通過在屬水平上的物種注釋結(jié)果可以看出，樣品FBSF和MBSF中菌屬的結(jié)構(gòu)及相對豐度不同，其中FBSF組中益生菌屬的相對豐度高于MBSF組。同時，根據(jù)Alpha多樣性分析結(jié)果可知，絲狀酸筍（FBSA）的Shannon、Simpson及ACE指數(shù)均顯著高于塊狀發(fā)酵酸筍（MBSF）（P＜0.05），所以絲狀酸筍可能更有利于無鹽發(fā)酵酸筍的生產(chǎn)。將塊狀酸筍組（MBSF）與10年老酸水組（BSFAF）對比發(fā)現(xiàn)，MBSF中微生物菌群的豐富度和均勻性顯著高于10年老酸水泡制的酸筍，由此說明以泉水泡制發(fā)酵酸筍可能更好。

此外，本試驗發(fā)現(xiàn)無鹽發(fā)酵酸筍體系中存在大量乳酸菌類存在，是一個乳酸菌資源庫。之后的研究應(yīng)對發(fā)酵全過程為研究重點(diǎn)，全面剖析發(fā)酵過程中微生物群落變化、營養(yǎng)變化、風(fēng)味變化規(guī)律，找到關(guān)鍵微生物及其基因，為竹筍生物技術(shù)加工提供強(qiáng)力技術(shù)支撐，為具有地域性特色的食材工業(yè)化、規(guī)?；⒖煽鼗峁├碚摶A(chǔ)。