陳旭峰，王佳麗，樊偉鑫，許女

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)a.實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，b.食品科學(xué)與工程學(xué)院山西太谷030801）

0 引 言

1979年，Brantle等人[1]首先報(bào)道發(fā)現(xiàn)了一類(lèi)短肽，其具有類(lèi)嗎啡活性，這類(lèi)短肽源自喂食了牛乳酪蛋白酶解產(chǎn)物的豚鼠小腸。該短肽命名為β-酪啡肽-7(β-casomorphins-7，β-CM-7)，是由 7個(gè)氨基酸組成，對(duì)應(yīng)于β-酪蛋白第60～66氨基酸殘基片段。此后，人們對(duì)于有關(guān)乳源性活性肽的研究進(jìn)展十分迅速，并且逐步成為乳品界的探索重點(diǎn)。人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可能廣泛存在一些功能域于乳蛋白多肽鏈中，許多生物活性肽包含在其中，并且蛋白酶水解作用可以將其釋放，使其在體內(nèi)表現(xiàn)出特定的生理作用。目前人們對(duì)于乳源抗氧化活性肽的探究重點(diǎn)為抗高血壓肽[2]、免疫調(diào)節(jié)肽[3-4]、抗血栓肽[5]、促進(jìn)金屬離子吸收的肽[6-7]、抗菌肽[8-9]、細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)[10]、阿片肽等[11]，而關(guān)于抗氧化活性肽的研究則相對(duì)較少。

沈浥[12]通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化了胰蛋白酶水解乳清蛋白以制備抗氧化肽工藝，最終獲得的酶解產(chǎn)物在濃度為10 mg/mL時(shí)1，1-二苯基-2-苦基肼基自由基(1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)清除率為78.78%，并且大孔純化產(chǎn)物通過(guò)凝膠過(guò)濾色譜Sephadex G-15和反相高效液相色譜(Reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC)分離，最終獲得兩個(gè)肽段A3a和A3b，具有較好的抗氧化活性。劉志東等[13]則比較了4種不同的酶水解酪蛋白產(chǎn)物的抗氧化性，結(jié)果表明木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解產(chǎn)物清除DPPH、超氧陰離子自由基(O2-·)、羥自由基(·OH)的能力強(qiáng)于胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶酶解產(chǎn)物；而后兩者酶解產(chǎn)物的還原性卻強(qiáng)于前兩者。毛學(xué)英等[14]和紀(jì)銀莉等[15]對(duì)牦牛乳酪蛋白酶解過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化及抗氧化活性研究，結(jié)果表明具有DPPH自由基清除能力的酪蛋白酶解產(chǎn)物的制備采用堿性蛋白酶時(shí)產(chǎn)量較高，卻具有含量較低的氨基氮，適合作為具有功能性的健康食品基材。

本文主要優(yōu)化了酪蛋白酶解制備抗氧化肽的工藝，系統(tǒng)研究了體外和體內(nèi)抗氧化活性，并進(jìn)行了耐熱性、耐酸堿性、耐消化性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性試驗(yàn)，為其廣泛的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、DPPH、鄰苯三酚、抗壞血酸(Vitamin C，VC)、丙二醛(Malonaldehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒、水楊酸、三氯化鐵、過(guò)氧化氫、鐵氰化鉀等。

酶生產(chǎn)廠(chǎng)家提供的各種蛋白酶的最適反應(yīng)p H值以及溫度條件如表1所示。

表1 各種蛋白酶的最適反應(yīng)條件

1.2 儀器與設(shè)備

BS2010S電子分析天平、電熱鼓風(fēng)干燥箱、TDL-4低速離心機(jī)、HHS-21-4數(shù)顯恒溫水浴鍋、F22E可見(jiàn)分光光度計(jì)、R 201D-11旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、真空冷凍干燥機(jī)、SM 800臨床專(zhuān)用全自動(dòng)酶標(biāo)儀。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酪蛋白酶解物的制備

稱(chēng)取酪蛋白30 g溶于500 mL蒸餾水中，加入蛋白酶啟動(dòng)反應(yīng)。水解過(guò)程中維持最適酶反應(yīng)溫度，最適pH值，并不斷攪拌，分別在0，30，60，90，120，150，180，210，240 min取樣，調(diào)pH到7.0，煮沸滅酶10 min，冷卻后，在4℃，以4 000 r/min離心20 min，測(cè)定部分上清液的蛋白水解度，并將其余上清液凍干以分析抗氧化活性。

1.3.2 酪蛋白水解度及酶解物肽濃度的測(cè)定

按照文獻(xiàn)[16]中的方法，采用甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法測(cè)定水解蛋白液中-NH2的含量(μmol/mL)，水解度計(jì)算公式如下：

式中：htot為每g蛋白質(zhì)的肽鍵毫摩爾數(shù)，查得酪蛋白htot=8.2(mmol/g)；6.25×N為水解底物蛋白質(zhì)含(g/L)，本實(shí)驗(yàn)酪蛋白為11.66。

按照文獻(xiàn)[10]中的方法，采用Folin酚法測(cè)定多肽濃度。

1.3.3 體外抗氧化活性測(cè)定

按照文獻(xiàn)[17]中的方法，對(duì)酪蛋白水解物凍干樣品進(jìn)行總還原能力、羥自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(O2—·)、一氧化氮自由基(NO·)的清除能力和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 體內(nèi)抗氧化活性測(cè)定

（1）D-半乳糖致衰老模型 將小鼠按體重隨機(jī)分為三組，即：正常對(duì)照組(每日灌胃生理鹽水)，模型組(每日灌胃生理鹽水)，CTH組(每日灌胃酪蛋白胰蛋白酶水解物 400 mg/kg.bw)，每組各10只，模型組和CTH組每日頸背部皮下注射用生理鹽水配制的滅菌D-gal(150 mg/kg·d)，正常組補(bǔ)充等量生理鹽水，連續(xù)6周，自由飲食。

（2）抗氧化指標(biāo)檢測(cè)及方法 采用試劑盒對(duì)小鼠血清、肝、腦組織中SOD活性、GSH-Px活性和MDA含量進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同蛋白酶對(duì)酪蛋白酶解物性質(zhì)的影響

肽的氨基酸序列和酶解物的抗氧化活性有著密切聯(lián)系，各種蛋白酶的底物特異性以及作用位點(diǎn)的不同對(duì)其起到?jīng)Q定性作用，根據(jù)酶生產(chǎn)廠(chǎng)家提供的酶的最適反應(yīng)p H值以及溫度條件(見(jiàn)表1)，考察不同蛋白酶對(duì)酪蛋白酶解物水解度及DPPH清除率的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖1和圖2所示。

圖1 各種蛋白酶對(duì)酪蛋白的酶解進(jìn)程曲線(xiàn)

由圖1可知，酶解酪蛋白后水解度最高的是堿性蛋白酶和胰蛋白酶。在120 min內(nèi)，各種酶水解酪蛋白的水解度都隨水解時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增大，120 min時(shí)水解度達(dá)到最大值(除堿性蛋白酶外)，之后趨于穩(wěn)定，說(shuō)明此時(shí)大多數(shù)的酪蛋白已經(jīng)被酶水解成小肽段和游離氨基酸。對(duì)于中性蛋白酶，120 min后水解度呈下降趨勢(shì)，水解度的降低是由于一些游離氨基酸與小肽的結(jié)合作用，由此導(dǎo)致了此類(lèi)現(xiàn)象的出現(xiàn)。此結(jié)果與葉挺等[18]在不同蛋白酶和水解條件對(duì)酪蛋白酶解產(chǎn)物性質(zhì)的影響研究中得到的結(jié)論相似，其結(jié)果表明堿性蛋白酶水解酪蛋白的速度最快，酪蛋白的水解程度最大，說(shuō)明酪蛋白上有較多的堿性蛋白酶酶切位點(diǎn)。

圖2 酪蛋白不同酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率

圖2 為120 min時(shí)酪蛋白經(jīng)各種酶水解產(chǎn)物測(cè)得的DPPH清除率。由圖2可知雖然堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度最高，但其產(chǎn)物抗氧化活性卻低于胰蛋白酶酶解產(chǎn)物。因?yàn)椴煌拿笇?duì)酪蛋白中所含的各種蛋白的底物特異性以及作用位點(diǎn)有區(qū)別，獲得的酶解產(chǎn)物的肽鏈結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)度有差異，并導(dǎo)致其活性大小也有可能有差別。通常人們預(yù)期得到的生物活性肽是分子量較小的短肽。沈浥[12]在酶解乳清蛋白制備抗氧化肽的研究中也得到相似結(jié)論，即水解度與抗氧化活性并不總是呈現(xiàn)正比關(guān)系。

毛學(xué)英等[14]和紀(jì)銀莉等[15]以牦牛乳酪蛋白為原料，利用胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶，木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶制備酪蛋白酶解產(chǎn)物，并分別測(cè)定其DPPH自由基清除活性，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的清除活性顯著高于其他酶解產(chǎn)物(P＜0.05)。劉志東等[13]證明木瓜蛋白酶和胃蛋白酶水解酪蛋白產(chǎn)物比胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶酶解物具有更強(qiáng)的DPPH、超氧陰離子自由基、羥基自由基的清除活性；然而比較其還原能力，則胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶酶解物比木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解物強(qiáng)。而在本文中胰蛋白酶水解產(chǎn)物具有最強(qiáng)的抗氧化活性。因此，底物蛋白種類(lèi)不同，即使都是酪蛋白，來(lái)源不同(牦牛和奶牛)，其制備抗氧化肽最適的酶不同。

2.2 酶解工藝優(yōu)化

2.2.1 底物濃度對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響

選用胰蛋白酶，當(dāng)條件為pH 8.0，T為50℃，加酶量[E]/[S]為3%時(shí)水解120 min，探究底物濃度[S]對(duì)酪蛋白水解度以及抗氧化能力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖可知，在[S]為50 mg/mL以?xún)?nèi)，水解度和抗氧化活性隨底物濃度的升高而不斷增強(qiáng)，當(dāng)[S]為50 mg/mL時(shí)，酶已由于底物而達(dá)到飽和，酶分子與底物作用，之間碰撞的可能性很大，產(chǎn)生劇烈反應(yīng)，水解度(Degree of hydrolysis，DH)和DPPH自由基清除率達(dá)到最高，分別為26%和60.2%。隨著增加底物的濃度，體系中水的流動(dòng)性被高濃度的蛋白所束縛，導(dǎo)致酶分子與底物之間的碰撞機(jī)會(huì)逐步減少，致使降低酶解的反應(yīng)速率，另外，蛋白濃度太高，會(huì)使得蛋白能夠占據(jù)酶分子的部分活性位點(diǎn)，從而使中間產(chǎn)物形成，這些沒(méi)有活性的中間產(chǎn)物，抑制了酶解反應(yīng)，逐步降低了水解度[12]。

圖3 底物濃度對(duì)酪蛋白水解度和DPPH自由基清除率的影響

2.2.2 加酶量對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響

選用胰蛋白酶，當(dāng)條件為p H 8.0，T為50℃，[S]為50 mg/mL時(shí)，水解120 min，探究加酶量[E]/[S]對(duì)酪蛋白水解度和抗氧化活性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖可知，隨著加酶量的增加，水解度和DPPH自由基清除率也顯著提高(P＜0.05)，當(dāng)[E]/[S]為4%時(shí)，底物被飽和，水解度和DPPH自由基清除率均不再顯著提高(P＞0.05)。酶的數(shù)量超過(guò)一定限度而多余，單位時(shí)間內(nèi)一部分酶分子不能與底物相結(jié)合，就會(huì)使得水解程度的增加過(guò)程變慢。

圖4 加酶量對(duì)酪蛋白水解度和DPPH自由基清除率的影響

2.2.3 溫度對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響

選用胰蛋白酶，當(dāng)條件為[E]為50 mg/mL，[E]/[S]為4%，pH 8.0時(shí)，水解120 min，研究溫度對(duì)水解度和抗氧化能力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，隨著酶解溫度的不斷升高，水解度會(huì)逐步增加(P＜0.05)，在溫度為50℃的時(shí)候酶解產(chǎn)物的水解度以及DPPH自由基清除率達(dá)到最高，當(dāng)溫度達(dá)到55℃時(shí)，水解度和抗氧化活性均呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。溫度過(guò)高或過(guò)低時(shí)，都會(huì)發(fā)生抑制作用導(dǎo)致酶的活性降低，其中也可看出水解度和DPPH自由基清除率之間呈線(xiàn)性關(guān)系，二者出現(xiàn)了相同變化趨勢(shì)，同時(shí)溫度過(guò)高時(shí)會(huì)破壞蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其失去活性，使抗氧化活性下降。此研究與侯楚楚[19]研究的酪蛋白水解肽制備條件優(yōu)化的結(jié)果一致，50℃為最佳酶解溫度。

圖5 溫度對(duì)酪蛋白水解度和DPPH自由基清除率的影響

2.2.4 pH值對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響

選用胰蛋白酶，當(dāng)條件為[S]為50 mg/mL，[E]/[S]為4%，T為50℃時(shí)水解120 min，研究pH值對(duì)抗氧化活性以及水解度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖可知，在pH 7.0～8.5之間，水解度和DPPH清除率均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在pH 7.5的時(shí)候達(dá)到峰值。與侯楚楚[19]研究結(jié)果一致，在p H小于7.5時(shí)，酶解速率非?？?，水解度隨p H的增大而減??；當(dāng)p H大于7.5時(shí)，水解度隨著pH的增大而減小。

圖6 pH對(duì)酪蛋白水解度和DPPH自由基清除率的影響

2.2.5 時(shí)間對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響

選用胰蛋白酶，當(dāng)條件為[S]為50 mg/mL，[E]/[S]為4%，T為50℃，pH為7.5時(shí)，研究水解時(shí)間對(duì)抗氧化活性及水解度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖可知，隨著水解時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，水解度會(huì)持續(xù)增加，在150 min時(shí)趨于穩(wěn)定，水解度達(dá)到34.5%，這是由于隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，反應(yīng)位點(diǎn)不斷被酶分子飽和，導(dǎo)致可以同酶分子作用的肽鍵數(shù)目逐步減少；同時(shí)產(chǎn)物濃度不斷增加，形成了較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。在水解時(shí)間為120 min條件下，DPPH自由基清除率達(dá)到最高，為68.1%。侯楚楚[19]也得到相似結(jié)論，研究表明隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，酪蛋白分子逐漸水解成多肽和氨基酸的混合物，在0～30 min內(nèi)，酶解速率較快，之后慢慢的趨于平緩狀態(tài)。這是因?yàn)殡S著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，胰蛋白酶酶切作用位點(diǎn)減少，從而反應(yīng)趨緩。

圖7 水解時(shí)間對(duì)酪蛋白水解度和DPPH自由基清除率的影響

2.3 酪蛋白胰酶水解物的體外抗氧化活性

由表2可知，酪蛋白胰酶水解物的還原能力隨濃度的增加而增大，說(shuō)明其具有較強(qiáng)的還原能力，因而具有較高的抗氧化活性，與劉志東[13]的研究結(jié)果一致，但本試驗(yàn)高于其研究的酪蛋白胰酶水解物的還原能力。此酪蛋白酶解物不僅具有可以很好地清除DPPH自由基的能力，對(duì)·OH和NO·自由基的清除也有著很好的作用，并且具有濃度相關(guān)性，當(dāng)多肽濃度為10 mg/mL時(shí)，對(duì)二者的清除率分別可以達(dá)到45.2%和61.5%，當(dāng)濃度升高到30 mg/mL時(shí)，其清除率分別達(dá)到62.4%和79.5%；另外，其對(duì)O2-·及Fe2+誘發(fā)的卵黃脂蛋白脂質(zhì)過(guò)氧化都具有一定的清除和抑制能力。Pritchard等[20]從商業(yè)切達(dá)干酪中分離純化出一種DPPH清除能力很強(qiáng)的抗氧化活性肽，且肽的濃度越高，清除能力越強(qiáng)。Kong等[21]證明利用堿性蛋白酶水解乳清蛋白5小時(shí)后得到的水解物FRAP的清除能力最強(qiáng)，并最終證實(shí)分子量為0.1～2.8 ku的低分子量肽最具有抗氧化潛力。這些活性肽的具體抗氧化機(jī)制還不清楚，但研究顯示肽的抗氧化活性與其分子組成、結(jié)構(gòu)、疏水性和氨基酸的殘基位點(diǎn)有關(guān)。今后，我們需要對(duì)抗氧化活性肽的構(gòu)效關(guān)系作進(jìn)一步研究。

表2 酪蛋白胰酶水解物體外抗氧化活性

2.4 酪蛋白胰酶水解物的體內(nèi)抗氧化活性

機(jī)體受到氧化破壞會(huì)導(dǎo)致一些老年疾病和神經(jīng)性器質(zhì)病變，比如糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥、冠心病等，抗氧化肽可以阻止脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生，降低氧化壓力對(duì)機(jī)體造成的損傷。食品來(lái)源的抗氧化肽具有安全、活性強(qiáng)、易吸收、成本低的特點(diǎn)，并且不會(huì)引起機(jī)體免疫反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)的優(yōu)點(diǎn)。

表3，表4和表5顯示了酪蛋白胰酶水解物對(duì)小鼠血清、肝、腦組織MDA含量、SOD和GSH-Px活性的影響。結(jié)果表明對(duì)于小鼠血清、肝臟和腦組織中的MDA含量，模型組相比于正常對(duì)照組顯著增加(P＜0.05)。而CTH組小鼠血清、肝和腦組織中的MDA含量顯著低于模型組(P＜0.05)，說(shuō)明酪蛋白胰酶水解物（CTH）對(duì)肝、腦組織和血清脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)有明顯降低的作用，并且，相比于對(duì)照組，酪蛋白胰酶水解物（CTH）組的小鼠血清、臟和腦組織中的SOD和GSH-Px活性也顯著升(P＜0.05)。

Martha等[22]發(fā)現(xiàn)酪蛋白中性蛋白酶水解物可以影響人體Jurkat T細(xì)胞中CAT和GSH的活性。齊微微等[23]利用堿性蛋白酶水解制得的乳清蛋白肽對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃實(shí)驗(yàn)，灌胃乳清蛋白肽自然衰老小鼠的SOD和GSH-Px活性顯著增加，MDA和蛋白質(zhì)羰基濃度顯著降低，同時(shí)乙酰膽堿脂酶的活性也有所降低。包怡紅等[24]觀(guān)察了乳清蛋白肽對(duì)衰老小鼠體內(nèi)抗氧化能力的影響，發(fā)現(xiàn)衰老小鼠血漿、肝臟、腦組織勻漿中CAT、SOD、GSH-Px含量均顯著降低，MDA含量顯著升高，與正常小鼠比較差異顯著，200、400 mg/(kgbw·d)乳清蛋白肽可以提高衰老小鼠血漿、肝臟、腦組織中CAT、SOD、GSH-Px含量，降低MDA含量，與衰老模型組比較差異有顯著性，乳清蛋白肽能顯著提高亞急性衰老小鼠的抗氧化能力，具有量效關(guān)系。今后，我們需要對(duì)抗氧化活性肽的構(gòu)效關(guān)系及體內(nèi)抗氧化機(jī)制作進(jìn)一步研究。

表3 酪蛋白胰酶水解物對(duì)小鼠血清、肝、腦組織MDA含量的影響

表4 酪蛋白胰酶水解物對(duì)小鼠血清、肝、腦組織SOD活性的影響

表5 酪蛋白胰酶水解物對(duì)小鼠血清、肝、腦組織GSH-Px活性的影響

2.5 酪蛋白胰酶水解物的穩(wěn)定性研究

2.5.1 酪蛋白胰酶水解物的耐消化穩(wěn)定性

肽類(lèi)產(chǎn)品的功能性必須考慮其添加在產(chǎn)品中后經(jīng)消化道后的穩(wěn)定性。本文通過(guò)體外模擬胃腸道消化過(guò)程，采取消化酶[E]/[S]=2%，37℃消化4 h來(lái)測(cè)定CTH的耐消化穩(wěn)定性。如圖8所示，CTH在胃蛋白酶作用之后，DPPH自由基清除率降低，其原因?yàn)椴糠值鞍纂亩我蛭傅鞍酌傅乃庾饔枚淮驍?，致使小幅度降低了抗氧化能力。而胰蛋白酶的作用?duì)活性無(wú)顯著影響(P＞0.05)，表明消化道酶對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行作用后，仍然可以耐受胃腸道蛋白酶作用，以較高的活性參與體內(nèi)的抗氧化過(guò)程。試驗(yàn)結(jié)果較紀(jì)銀莉[15]的研究結(jié)果相比有所差異，其研究表明水解產(chǎn)物經(jīng)過(guò)胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后，清除DPPH的能力會(huì)下降，胰蛋白酶處理對(duì)水解產(chǎn)物的抗氧化活性影響最大。而劉珊珊等[25]則研究表明酪蛋白抗氧化肽經(jīng)胃蛋白酶消化后其抗氧化活性顯著下降，在隨后的模擬腸消化中抗氧化活性逐漸回升，甚至完全恢復(fù)到消化前的水平。

圖8 酪蛋白胰酶水解物耐消化穩(wěn)定性

2.5.2 酪蛋白胰酶水解物的耐熱、耐酸堿穩(wěn)定性

分析CTH對(duì)熱、酸、堿等常用加工、生產(chǎn)、儲(chǔ)藏和應(yīng)用處理方式的耐受性，對(duì)確保生物活性及保存期限特別重要。采用在不同p H緩沖液中，沸水浴處理不同時(shí)間后比較其DPPH自由基清除率(見(jiàn)表6)。在不同的pH緩沖液中，抗氧化肽的離子狀態(tài)會(huì)因pH的不同而有所差異，進(jìn)而對(duì)其抗氧化活性造成影響，CTH在p H為5～7時(shí)能保持較高的抗氧化活性，在p H為3和pH為9～11時(shí)未經(jīng)熱處理時(shí)活性明顯降低，這可能是發(fā)生了分解、降解、聚合等反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)物失活。經(jīng)過(guò)熱處理后活性顯著降低，這是因?yàn)楫a(chǎn)物在加熱的過(guò)程中會(huì)經(jīng)歷某種程度上的水解，并且抗氧化肽由于高溫而失活。

表6 酪蛋白胰酶水解物的耐熱、耐酸堿穩(wěn)定（DPPH清除率/%）

2.5.3 酪蛋白胰酶水解物的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性

明確酪蛋白胰酶水解物的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，確保其在儲(chǔ)存期內(nèi)的生理功能活性穩(wěn)定性非常重要。由表7可知，伴隨著儲(chǔ)存時(shí)間的持續(xù)增加，產(chǎn)物的DPPH自由基清除活性均顯著低于新鮮制備產(chǎn)(P＜0.05)，產(chǎn)物在低溫條件下儲(chǔ)藏相較于常溫具有顯著的穩(wěn)定性(P＜0.05)。儲(chǔ)藏于-18℃下3個(gè)月，活性降低約6%，6個(gè)月降低約17%。在4℃下儲(chǔ)藏穩(wěn)定性相較于冷凍保藏低，6個(gè)月后活性降低21%，貯藏穩(wěn)定性較好。

表7 酪蛋白胰酶水解物的耐儲(chǔ)藏穩(wěn)定性(DPPH清除率/%)

3 結(jié) 論

本文對(duì)酪蛋白酶解制備抗氧化肽的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并研究了酪蛋白胰酶水解物的抗氧化活性及穩(wěn)定性。最優(yōu)酶解條件下，水解度為30.1%，DPPH自由基清除率為68.1%。此酪蛋白胰蛋白酶水解物對(duì)羥自由基(·OH)和一氧化氮自由基(NO·)也有著較好的清除效果，并且其對(duì)超氧陰離子自由基(O2-·)及亞鐵離子(Fe2+)誘發(fā)的卵黃脂蛋白脂質(zhì)過(guò)氧化都具有一定的清除和抑制能力。小鼠實(shí)驗(yàn)表明，酪蛋白胰蛋白酶水解物體現(xiàn)出較好的體內(nèi)抗氧化作用。穩(wěn)定性試驗(yàn)證明酪蛋白酶解產(chǎn)物具有良好的耐消化、耐熱、耐酸堿和耐儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，體現(xiàn)了其作為抗氧化功能原料的良好應(yīng)用潛力。