馮婉瑩，劉結(jié)容，鄭學(xué)殷，馬盛龍，羅浩，區(qū)碩俊，曾廣豐

（1.廣州檢驗檢測認(rèn)證集團(tuán)有限公司，國家加工食品質(zhì)量檢驗中心（廣東），廣州511447；2.廣東檢驗檢疫技術(shù)中心，廣州510623）

0 引 言

乳制品是使用牛乳或羊乳及其加工制品為主要原料，添加劑、營養(yǎng)強(qiáng)化劑或礦物質(zhì)等為輔料的加工制作而成的一類食品。當(dāng)牛乳或羊乳等產(chǎn)品經(jīng)過加熱滅菌后，乳中蛋白質(zhì)和乳糖會發(fā)生美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生出糠氨酸[1]，同時加熱過程中產(chǎn)品質(zhì)量會受到影響[2-3]?？钒彼岬暮靠梢杂糜谂袛喈a(chǎn)品經(jīng)過受熱后，營養(yǎng)物質(zhì)的損失程度，因此是作為評價液態(tài)乳質(zhì)量優(yōu)劣的一個重要指標(biāo)[4-5]。

目前乳制品中糠氨酸的檢測方法主要有液相色譜法[6-10]，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-12]和毛細(xì)管色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[13]。本文采用直接酸水解方法，同時使用超高效液相色譜，使分析時間縮短，結(jié)合高分辨飛行時間質(zhì)譜，精確測定分子量，建立了測定液態(tài)乳中糠氨酸的高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法（UPLC-Q-TOF/MS）。

1 實驗

1.1 儀器與設(shè)備

Triple TOF 5600+高分辨質(zhì)譜儀，UPLC 20AD高效液相色譜儀，D3024R冷凍高速臺式離心機(jī)，CSR-1-200超純化水機(jī)，高真空干燥箱XFM 320。

1.2 材料與試劑

液態(tài)乳樣品（保質(zhì)期內(nèi)測定）；鹽酸、甲酸（分析純）；乙腈（色譜純）；糠氨酸鹽酸鹽（純度99.8%）。

1.3 實驗條件

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取糠氨酸鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品各0.0500 g于100 mL棕色具塞容量瓶中，用濃度為1 mol/L鹽酸溶液定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再用純水稀釋成質(zhì)量濃度為20 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液。準(zhǔn)確移取相應(yīng)體積的標(biāo)準(zhǔn)中間液，用純水稀釋成質(zhì)量濃度為10，20，50，100，200，500，1000μg/L的工作曲線。

1.3.2 樣品處理

準(zhǔn)確稱取液態(tài)奶樣品2 g于耐熱具旋塞玻璃管中，加入質(zhì)量濃度為10.8 mol/L鹽酸6 mL，充入氮氣保護(hù)后放至110℃烘箱24 h。待樣液冷卻至室溫以后，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，再用5 mL去離子水洗滌玻璃管，并將洗滌液轉(zhuǎn)移至離心管中。轉(zhuǎn)速為10 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中。再往50 mL離心管中加入10 mL去離子水，渦旋5min，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min離心5 min，上清液合并至25 mL比色管中，水定容搖勻后過0.22μm水相膜待上機(jī)測定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Kinetex C18(100 mm×2.1 mm，2.6μm)；柱溫為35℃；樣品室溫度20℃；進(jìn)樣量為5 μL；流動相A為乙腈，B為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液，采用梯度洗脫方式洗脫分離；流速為0.5 mL/min。梯度洗脫程序：0.0～2.0 min，乙腈（A）體積分?jǐn)?shù)為5%；2.0～5.0 min，乙腈（A）體積分?jǐn)?shù)從5%增加到60%；5.0～6.0 min，乙腈（A）體積分?jǐn)?shù)為60%；6.0～6.1 min，乙腈（A）體積分?jǐn)?shù)從60%減少到5%；6.1～8.0 min，乙腈（A）體積分?jǐn)?shù)5%。

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子源：ESI和APCI復(fù)合源；正離子/負(fù)離子掃描方式；APCI源連接ABsciex公司自動校正系統(tǒng)(CDS)，每5個樣品自動校正1次，APCI正離子校正液流速0.5 mL/min，氣簾氣（N2）：0.207 MPa，離子源霧化氣（N2）：0.345 MPa，離子源加熱輔助氣（N2）：0.345 MPa，離子源溫度為500℃，離子源電壓5 000V。一級TOF-MS掃描準(zhǔn)確質(zhì)量范圍為50～1 000 u；二級IDA-MS掃描準(zhǔn)確質(zhì)量范圍為50～1 000 u，DP為55V，CE為（30±10）V；高靈敏模式，數(shù)據(jù)采集時間50 ms，信號閾值100 cps，IDA實驗每循環(huán)采集6次數(shù)據(jù)，動態(tài)背景減法扣除。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析方法

所有質(zhì)譜數(shù)據(jù)在ABSciex公司的Analyst TF 1.6軟件采集，數(shù)據(jù)在Peak View 2.0，MasterView 2.0和MultiQuant 3.0等軟件上定性定量處理分析。根據(jù)TOF-MS和IDA-MS高分辨質(zhì)譜獲得化合物的準(zhǔn)確分子量，定性定量分析測定液態(tài)奶中的糠氨酸質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析依據(jù)

采用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜方法檢測分析液態(tài)奶中的糠氨酸，以一級母離子的精確質(zhì)量數(shù)、同位素豐度比、二級碎片子離子的精確質(zhì)量數(shù)作為定性依據(jù)和色譜保留時間等信息作為定性依據(jù)，母離子響應(yīng)強(qiáng)度為定量分析依據(jù)?？钒彼岬馁|(zhì)譜分析依據(jù)見表1，標(biāo)準(zhǔn)品提取離子流色譜圖和二級質(zhì)譜如圖1和圖2所示。

表1 糠氨酸的質(zhì)譜分析結(jié)果

圖1 糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)品提取離子流色譜

圖2 糠氨酸二級精確分子量質(zhì)譜

2.2 樣品處理條件的選擇

為防止水解過程中，美拉德反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行而導(dǎo)致糠氨酸測得值偏高，鹽酸溶液的濃度一般要在6 mol/L以上。因此實驗前期選取濃度為10.8 mol/L鹽酸溶液進(jìn)行水解，可忽略美拉德反應(yīng)對實驗結(jié)果的影響。同時，對水解溫度和時間對糠氨酸回收率的影響進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水解溫度對回收率影響較大，當(dāng)溫度低于100℃時，水解時間會較長，而溫度過高，有可能導(dǎo)致體系內(nèi)沸騰，回收率也會下降。因此選取110℃為最終的反應(yīng)溫度，在此條件下，當(dāng)水解時間延長至24 h以上時，回收率趨于穩(wěn)定，日內(nèi)6次平行測定平均回收率為86.0%。詳細(xì)結(jié)果如圖3所示。

2.4 線性關(guān)系和檢出限

精確吸取相應(yīng)體積的標(biāo)準(zhǔn)中間液并用純水稀釋成標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，在優(yōu)化后的色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定，以X(μg/L)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程為Y=975.76X-4.1549，相關(guān)系數(shù)為r為0.9997，說明糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)良好線性，具有準(zhǔn)確定量的能力。分別按信噪比的3倍(S/N=3)和10倍(S/N=10)，計算檢出限(LOD)和定量限(LOQ)，結(jié)果測定糠氨酸的方法檢出限為250μg/kg，定量限為800μg/kg，表明方法具有較高的靈敏度。

圖3 水解溫度對回收率的影響

2.4 回收率與精密度實驗

選用本底較低的生牛乳作為加標(biāo)回收樣品，對同一樣品進(jìn)行重復(fù)測定6次，取結(jié)果平均值作為樣品的本底值，以本底值為基準(zhǔn)進(jìn)行3個不同水平濃度的加標(biāo)回收實驗，每個水平日內(nèi)重復(fù)測定6次。平均回收率在84.0%～86.2%中間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.08%～4.01%。結(jié)果表明，方法的回收率高，精密度好，在日內(nèi)考察中，達(dá)到日常分析測定的要求。詳細(xì)結(jié)果如表2所示。

表2 生牛乳中糠氨酸的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)μg/kg

2.5 樣品實際測定應(yīng)用

隨機(jī)抽取市面上流通的生牛乳、巴氏殺菌乳、UHT殺菌乳和煉乳各20個樣品，采用本方法進(jìn)行測定，其中生牛乳糠氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為0.25～1.1 mg/kg，巴氏殺菌乳為0.85～2.1 mg/kg，UHT殺菌乳為12～73 mg/kg，煉乳為290～380 mg/kg。說明所測定的樣品在加工殺菌等生產(chǎn)工藝過程中產(chǎn)生了一定的營養(yǎng)損失或使用了復(fù)原乳，對產(chǎn)品的品質(zhì)有一定的影響。

3 結(jié) 論

本文采用鹽酸溶液對液態(tài)乳進(jìn)行酸水解，省去氮氣吹干復(fù)溶的步驟。建立的超高效液相色譜-高分辨飛行時間質(zhì)譜方法使糠氨酸在4 min內(nèi)出峰，且峰型良好，縮短了分析時間，利用四級桿篩選后，大大減少了雜質(zhì)對目標(biāo)物的干擾，并且高分辨四級桿飛行時間質(zhì)譜能夠更加精確地確定分子量，對于目標(biāo)物的定性定量分析也更為精確。方法學(xué)結(jié)果表明，該方法操作簡單方便，回收率高，且選擇性和靈敏度高，適用于液態(tài)乳中糠氨酸含量的實際分析測定，為液態(tài)乳中糠氨酸測定方法的研究開發(fā)提供了參考依據(jù)。